應(yīng)用人工神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究①

王曉亮，楊朝陽，李曉光，張皚峰

應(yīng)用人工神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究①

王曉亮，楊朝陽，李曉光，張皚峰

目的 觀察應(yīng)用復(fù)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)-殼聚糖導(dǎo)管修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)損傷的效果。方法成年Wistar大鼠25只分為假手術(shù)組(n=10)、單純損傷組(n=5)和人工神經(jīng)修復(fù)組(n=10)。假手術(shù)組僅暴露坐骨神經(jīng)5 mm，單純損傷組暴露坐骨神經(jīng)并切斷，人工神經(jīng)修復(fù)組以復(fù)合bFGF-殼聚糖導(dǎo)管橋接缺損。術(shù)后對實驗動物的坐骨神經(jīng)進(jìn)行大體觀察，對運(yùn)動進(jìn)行行為觀察，以及組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)方法評價神經(jīng)再生情況和靶肌肉恢復(fù)情況。結(jié)果術(shù)后5周，與單純損傷組相比，人工神經(jīng)修復(fù)組運(yùn)動功能有一定程度恢復(fù)。人工神經(jīng)修復(fù)組再生的坐骨神經(jīng)已經(jīng)通過bFGF-殼聚糖導(dǎo)管越過缺損并與遠(yuǎn)端相連接。免疫組織化學(xué)方法顯示，坐骨神經(jīng)再生段可觀察到神經(jīng)微絲(NF)陽性和S-100陽性纖維。應(yīng)用Masson染色方法，可觀察到人工神經(jīng)修復(fù)組腓腸肌去纖維化程度相對于單純損傷組有明顯改善。結(jié)論應(yīng)用bFGF-殼聚糖導(dǎo)管能有效修復(fù)周圍神經(jīng)損傷并使大鼠運(yùn)動功能得到改善。

周圍神經(jīng)損傷；人工神經(jīng)移植；神經(jīng)再生；堿性成纖維細(xì)胞生長因子；殼聚糖；功能恢復(fù)

周圍神經(jīng)損傷是臨床外科常見的疾病，會造成患者相關(guān)肢體的運(yùn)動功能障礙和感覺功能缺失。臨床治療短距離周圍神經(jīng)損傷常施行端端吻合術(shù)，而治療長距離周圍神經(jīng)損傷則采用自體或異體神經(jīng)移植的方法。這些方法會對供體造成傷害，且異體移植會伴有免疫排斥的風(fēng)險。近年來隨著組織工程的發(fā)展，不斷有學(xué)者嘗試組織工程的方法構(gòu)建人工神經(jīng)來治療周圍神經(jīng)缺損[1]。應(yīng)用組織工程方法可以有效克服目前臨床上治療周圍神經(jīng)損傷的不足。組織工程化的人工神經(jīng)通常包括能為施萬細(xì)胞再生提供支架的橋梁以及促進(jìn)神經(jīng)軸索再生的成分。殼聚糖是一種來源于自然界的多聚糖，可通過人工控制其乙酰化程度來調(diào)節(jié)其降解速度，在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域都有極高的應(yīng)用價值。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)是具有有絲分裂源活性的陽離子多肽，具有保護(hù)神經(jīng)元和促進(jìn)神經(jīng)再生的作用[2]。本次實驗觀察采用bFGF-殼聚糖導(dǎo)管構(gòu)成的人工神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損。

1 材料和方法

1.1 材料 Wistar大鼠25只，體重200～220 g，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=10)，單純損傷組(n=5)和人工神經(jīng)修復(fù)組(n=10)。主要試劑：小鼠來源抗大鼠神經(jīng)微絲多克隆抗體(NF，SIGMA公司)、兔來源抗大鼠S-100蛋白(中杉金橋)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 用6%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉實驗大鼠(30 mg/kg)，對左后肢備皮后固定于鼠板上，常規(guī)消毒。沿左側(cè)股后部依次切開皮膚、皮下組織，分離半腱肌、半膜肌，暴露左側(cè)坐骨神經(jīng)主干并游離干凈。

假手術(shù)組：暴露5 mm坐骨神經(jīng)后不做任何處理，立即縫合肌肉和皮膚。

單純損傷組：暴露坐骨神經(jīng)后，切除坐骨神經(jīng)造成5 mm缺損，待其自然回縮后，縫合肌肉和皮膚。

人工神經(jīng)修復(fù)組：于股中部切除坐骨神經(jīng)造成5 mm缺損，以7/0無創(chuàng)縫合針在手術(shù)顯微鏡下，將人工神經(jīng)縫合于神經(jīng)外膜上，并使兩斷端分別進(jìn)入導(dǎo)管(導(dǎo)管長9 mm)內(nèi)約2 mm，逐層縫合肌肉和皮膚。

1.2.2 取材及固定 術(shù)后5周分別對各組實驗動物以4%多聚甲醛溶液經(jīng)心臟灌注固定，游離并切取左側(cè)坐骨神經(jīng)相應(yīng)再生段，同時取雙下肢腓腸肌、比目魚肌和趾長伸肌。所取組織經(jīng)蔗糖梯度脫水后，將新生的神經(jīng)組織和對照組相應(yīng)神經(jīng)干沿長軸方向縱向恒冷箱切片，切片厚12 μm；取腓腸肌標(biāo)本中部，恒冷箱切片，切片方向垂直肌纖維走行，切片厚16 μm。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 神經(jīng)組織切片經(jīng)PBST洗3次，每次5 min，入5%羊血清封閉30 min后，進(jìn)行S-100和NF雙重免疫組織化學(xué)染色。小鼠抗NF滴度為1∶50，兔抗S-100滴度為1∶100，一抗72 h后，分別加入Texas-red標(biāo)記的山羊抗鼠IgG熒光二抗(Jakson公司)和Cy2標(biāo)記的山羊抗兔IgG熒光二抗(Jakson公司)，滴度均為1∶100，室溫避光過夜，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 組織化學(xué)染色 取各組腓腸肌中段橫切片，入Masson復(fù)合染液10 min，0.2%醋酸稍洗，5%磷鎢酸分色5 min后入0.2%醋酸浸洗3 min，入苯胺藍(lán)溶液5 min，0.2%醋酸水洗兩次，每次3 min，常規(guī)脫水透明封片。光鏡下觀察肌肉橫截面及纖維化情況。

1.2.5 靶肌肉肌纖維面積比較 應(yīng)用Image-pro plus 6.1計量并比較靶肌肉肌纖維橫截面積。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)值以(xˉ±s)表示，采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后大體觀察 術(shù)后1周時，單純損傷組和人工神經(jīng)修復(fù)組大鼠均出現(xiàn)術(shù)側(cè)足不能跖屈。術(shù)后5周時，單純損傷組大鼠術(shù)側(cè)足仍不能跖屈，足趾有缺損并有趾甲缺失，足底可見潰瘍形成；人工神經(jīng)修復(fù)組大鼠也出現(xiàn)足趾破損，但程度較輕。假手術(shù)組大鼠均未見肢體損傷。將大鼠置于直徑1.5 m的圓形區(qū)域內(nèi)，任其自然行走，可觀察到單純損傷組大鼠在行走過程中，由于跖屈障礙術(shù)側(cè)肢體不能參與運(yùn)動，行走動作不協(xié)調(diào)，靜止?fàn)顟B(tài)時可見足外翻畸形(圖1B)。人工神經(jīng)修復(fù)組大鼠術(shù)側(cè)肢體能夠參與到行走動作中(圖1C)，但相對于假手術(shù)組(圖1A)幅度較小。

造模時人工神經(jīng)修復(fù)組經(jīng)人工神經(jīng)橋接后，可見損傷遠(yuǎn)近端均已被套接入殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)(圖2)。對大鼠灌流取材后可見單純損傷組的神經(jīng)殘端與周圍組織粘連，界限不清，損傷末端形成膨大瘤狀物(圖3A)。人工神經(jīng)修復(fù)組再生神經(jīng)已經(jīng)越過導(dǎo)管，并與遠(yuǎn)端相連(圖 3B)。

圖1 術(shù)后5周三組運(yùn)動能力大體觀察

2.2 再生神經(jīng)的免疫組織化學(xué)染色 分別以神經(jīng)微絲(NF200，紅色)和S-100(綠色)蛋白作為周圍神經(jīng)軸突和髓鞘的標(biāo)志物，假手術(shù)組兩種纖維呈波浪型，纖維數(shù)量多，排列密集(圖4A和B)。人工神經(jīng)修復(fù)組神經(jīng)再生段有大量的NF免疫陽性纖維和S-100免疫陽性纖維，其走行多與神經(jīng)長軸平行，但連續(xù)性略差(圖4D和E)。S-100是周圍神經(jīng)髓鞘特異性蛋白，人工神經(jīng)修復(fù)組和假手術(shù)組的合成圖中均可見到有S-100陽性纖維包繞NF陽性纖維(圖4C和F)，說明人工神經(jīng)修復(fù)組有髓神經(jīng)纖維成功再生，但相對于假手術(shù)組，神經(jīng)纖維數(shù)略少。人工神經(jīng)修復(fù)組神經(jīng)再生段可見NF纖維和S-100纖維的近管壁側(cè)相對管中央側(cè)密集而且直徑較粗，而假手術(shù)組兩種陽性纖維分布都很均勻。

2.3 相應(yīng)靶肌肉的Masson染色 Masson染色可用來鑒別肌纖維(紅色)和膠原纖維(藍(lán)色)。在假手術(shù)組中，肌束橫斷面染色鮮艷，分布均勻，肌纖維呈多邊形，肌纖維邊緣及間隙無膠原纖維沉積(圖5A)。單純損傷組中，由于失神經(jīng)性萎縮，肌纖維相對于假手術(shù)組染色黯淡，面積縮小且多呈梭形，肌纖維邊緣和間隙可見藍(lán)色膠原組織沉積(圖5B)。在人工神經(jīng)修復(fù)組中，可見肌纖維相對于單純損傷組橫截面積有明顯增大，染色較鮮艷。但相對于假手術(shù)組，肌纖維面積未完全恢復(fù)，肌纖維間隙中，尚有部分膠原纖維沉積(圖5C)。對各組肌纖維橫截面積進(jìn)行統(tǒng)計分析，單純損傷組的肌纖維橫截面積(174.27±85.03)μm2與人工神經(jīng)修復(fù)組(615.8±314.2)μm2有顯著性差異(P＜0.05)。

圖4 人工神經(jīng)修復(fù)組和假手術(shù)組NF和S-100免疫組織化學(xué)觀察

圖5 術(shù)后5周對各組靶肌肉的Masson染色

3 討論

周圍神經(jīng)損傷后能否實現(xiàn)成功再生，與損傷局部對軸突的接觸引導(dǎo)作用，神經(jīng)趨化性和再生微環(huán)境等因素密切相關(guān)[3]。在本次研究中，我們采用了有良好生物相容性，可被機(jī)體降解的天然生物活性材料殼聚糖作為導(dǎo)管，使之在周圍神經(jīng)再生過程中，為施萬細(xì)胞的再生提供支架從而起到橋梁作用，并且該材料制成的導(dǎo)管具有一定通透性，有利于神經(jīng)導(dǎo)管和周圍環(huán)境的營養(yǎng)物質(zhì)交換[4-5]，有利于新生血管的生長。bFGF最初被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)原代成纖維細(xì)胞分裂增殖故而命名。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)bFGF具備有絲分裂原活性，也可加強(qiáng)施萬細(xì)胞增殖；具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，能夠保護(hù)受損的神經(jīng)元，維持神經(jīng)元的再生與存活，并促進(jìn)周圍神經(jīng)軸突的生長。外源性應(yīng)用bFGF可以提高再生軸突的密度、直徑及髓鞘形成的質(zhì)量。bFGF在生物體內(nèi)半衰期很短，通過將bFGF與導(dǎo)管相結(jié)合，使bFGF緩釋到殼聚糖導(dǎo)管內(nèi)，能夠在周圍神經(jīng)再生過程中持續(xù)發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元和促軸突再生的作用。已有臨床試驗證實，bFGF的緩釋給藥效果明顯優(yōu)于一次給藥。

在本次實驗中，我們將bFGF以物理方式結(jié)合到殼聚糖導(dǎo)管上，并應(yīng)用該結(jié)構(gòu)的人工神經(jīng)橋接修復(fù)坐骨神經(jīng)5 mm缺損。通過大體觀察可見，在術(shù)后1周時，人工神經(jīng)修復(fù)組和單純損傷組的實驗動物術(shù)側(cè)肢體均出現(xiàn)跖屈功能障礙、足底破潰、趾甲缺失等運(yùn)動和感覺功能損傷。隨時間延續(xù)，人工神經(jīng)修復(fù)組運(yùn)動和感覺神經(jīng)再生，使跖屈功能障礙得以恢復(fù)，隨著感覺功能和自主神經(jīng)功能恢復(fù)，實驗動物能夠躲避傷害性刺激，肢體破潰逐漸愈合，趾甲復(fù)原。在術(shù)后5周時，通過對運(yùn)動能力的觀察發(fā)現(xiàn)，人工神經(jīng)修復(fù)組大鼠術(shù)側(cè)肢體跖屈功能接近假手術(shù)組，術(shù)側(cè)足底破潰愈合，說明通過人工神經(jīng)修復(fù)治療，大鼠后肢的運(yùn)動和感覺功能均得到明顯改善。

周圍神經(jīng)的傳導(dǎo)功能主要通過神經(jīng)束內(nèi)的軸突和包繞在軸突外面的髓鞘實現(xiàn)[6]。在術(shù)后5周，對各組實驗動物進(jìn)行灌流取材后，可看到人工神經(jīng)修復(fù)組導(dǎo)管內(nèi)再生神經(jīng)已越過缺損處，并與遠(yuǎn)端連接，導(dǎo)管內(nèi)尚有凝膠狀的bFGF-殼聚糖載體存留。本次實驗中，我們分別用NF和S-100蛋白特異性標(biāo)記周圍神經(jīng)的軸突和髓鞘[7-8]。修復(fù)后5周觀察到，兩種標(biāo)記物在再生段神經(jīng)中都有免疫陽性表達(dá)，人工神經(jīng)修復(fù)組的兩種纖維主要分布于靠近導(dǎo)管壁一側(cè)，粗細(xì)不一，排列密集；部分NF纖維可以被S-100纖維包繞，說明再生段中有髓神經(jīng)纖維能夠成功再生。但同時也可看到人工神經(jīng)修復(fù)組再生的NF纖維相對假手術(shù)組略少。

再生神經(jīng)對運(yùn)動功能的影響最終體現(xiàn)于靶肌肉[9]。當(dāng)周圍神經(jīng)被離斷后，由于傳導(dǎo)功能障礙，肌纖維由于失去神經(jīng)的營養(yǎng)作用，靶肌肉會發(fā)生一系列變化，最終形成廢用性萎縮，導(dǎo)致肌纖維數(shù)目下降，體積減少，膠原纖維增生。通過Masson染色可以觀察到，假手術(shù)組肌纖維橫截面積變小，呈梭形，肌纖維邊緣有膠原蛋白沉積。而人工神經(jīng)修復(fù)組的肌纖維，隨著神經(jīng)的再支配，肌纖維面積增大，膠原蛋白減少，但與假手術(shù)組尚有差距。對肌纖維的形態(tài)學(xué)觀察說明，伴隨著神經(jīng)的再生，其靶肌肉接受神經(jīng)營養(yǎng)的作用，并且得到再支配后其運(yùn)功功能得到改善，與之前觀察到的運(yùn)動能力恢復(fù)可相互印證[10]。

本次實驗通過對實驗動物的術(shù)側(cè)肢體大體觀察、運(yùn)動能力觀察、再生神經(jīng)和靶肌肉的形態(tài)學(xué)評價等方法，均可證明復(fù)合bFGF-殼聚糖載體的人工神經(jīng)能夠有效促進(jìn)周圍神經(jīng)再生，并使修復(fù)治療后的靶肌肉形態(tài)得到恢復(fù)，使得肌容積增加，最終促進(jìn)靶肌肉運(yùn)動功能的恢復(fù)。提示應(yīng)用復(fù)合bFGF-殼聚糖導(dǎo)管的人工神經(jīng)修復(fù)周圍神經(jīng)損傷具備臨床研究和應(yīng)用價值。

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Experimental Study on Sciatic Nerve Injury Repairing by Artificial Nerve Graft in RatsW

ANG Xiao-liang,YANG Zhao-yang,LI Xiao-guang,et al.Neuroscience Research Institute of Capital Medical University,Key Laboratory of Beijing Neuroregeneration Repair Research,Key Laboratory of Neural Degeneration of Ministry of Education,Beijing 100069,China

ObjectiveTo observe the effect of the chitosan tube combined with basic fibroblast growth factor(bFGF)on repairing sciatic nerve injury in rats.Methods25 adult Wistar rats were divided into modeled sham-operated group(n=10),lesion control group(n=5)and experiment group(n=10).All of them were operated with a 5-mm sciatic nerve exposed on the left.The lesion control group was intervened with the sciatic nerve cut off.The experiment group was intervened with bFGF-chitosan tubes bridged into nerve stumps.The movement behavior was observed,the regeneration of the injury nerves and the distal target muscle were detected by morphological staining.Results5 weeks after operation,the movement function of the experiment group was apparently recovered and gaps on the sciatic nerve were connected by the regeneration nerve in this group and NF and S-100 immunoreactive fibers were observed in regeneration nerve.Masson's trichrome stain showed that the target muscle was close to the level of sham-operated group in morphology and density.ConclusionThe chitosan tube combined with bFGF can repair the peripheral nerve injury effectively and improve the movement function of rats.

peripheral nerve injury;arti fi cial nerve graft;nerve regeneration;basic fibroblast growth factor;chitosan;function recovery

[本文著錄格式]王曉亮，楊朝陽，李曉光，等.應(yīng)用人工神經(jīng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)損傷的實驗研究[J].中國康復(fù)理論與實踐,2012,18(6):535-538.

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.06.011

1.國家863項目(2006AA20A129)；2.北京市自然科學(xué)基金重點項目(D09080703660902)。

1.首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所，北京市神經(jīng)再生修復(fù)研究重點實驗室，教育部神經(jīng)變性病學(xué)重點實驗室，北京市100069；2.北京市友誼醫(yī)院口腔科，北京市100050。作者簡介：王曉亮(1983-)，男，河北三河市人，碩士研究生，主要研究方向：應(yīng)用組織工程方法修復(fù)周圍神經(jīng)損傷。通訊作者：李曉光。

R651.3

A

1006-9771(2012)06-0535-04

2012-02-20

2012-03-29)

·綜述·