Rho激酶在糖尿病血管內(nèi)皮功能改變中的作用*

吳健美， 陳曉娜， 郭正祥， 紀(jì)曉微， 施巧雅，尹洪萍， 沈 禮， 汝海龍， 林國(guó)華， 劉傳飛， 劉翠清

(杭州師范大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理教研室，浙江杭州310036)

Rho激酶廣泛分布在哺乳類動(dòng)物的組織細(xì)胞中，是具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子開關(guān)等重要功能的分子多肽。近年的研究表明，Rho激酶是血栓烷受體(thromboxane receptor，TP受體)的主要效應(yīng)器酶，通過與血管緊張素II、內(nèi)皮素、血小板源生長(zhǎng)因子、5－羥色胺等多種血管活性物質(zhì)相互調(diào)控而影響平滑肌細(xì)胞的活動(dòng)，并參與心臟病的病理過程，與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠脈痙攣、心肌缺血等主要心血管疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［1－5］。我們前期結(jié)果表明Rho激酶可以抑制異丙腎上腺素(isoprenaline)的舒張血管作用，并通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣離子內(nèi)流從而降低內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelium nitric oxidase synthase，eNOS)活性導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂［6］。業(yè)已表明，內(nèi)皮功能失調(diào)是糖尿病血管并發(fā)癥的始動(dòng)環(huán)節(jié)，也是糖尿病患者致殘致死的一個(gè)主要因素。但是，Rho激酶在糖尿病血管內(nèi)皮損傷中的作用如何，尚缺乏系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察Rho激酶激活對(duì)血管內(nèi)皮依賴性舒張的影響以及在糖尿病血管損傷中的作用，為糖尿病血管并發(fā)癥的防治提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 儀器和藥品

Myograph血管張力系統(tǒng) (DMT 610)、PowerLab(AD儀器設(shè)備有限公司)、MedLab生物信號(hào)處理系統(tǒng)、張力換能器系統(tǒng)和恒溫恒速灌流系統(tǒng)、酶標(biāo)儀。法舒地爾購(gòu)自天津紅日藥業(yè)股份有限公司，去氧腎上腺素(phenylephrine，Phe)、乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)購(gòu)自Sigma，U46619(TP受體激動(dòng)劑)和Y27632(Rho激酶抑制劑)為香港中文大學(xué)黃聿教授所贈(zèng)?？贵wpeNOS和eNOS購(gòu)自Cell Signaling Technology。血栓烷 B2(thromboxane B2，TXB2)和前列腺素 F2α(prostaglandin F2α，PGF2α)ELISA 試劑盒購(gòu)自 R＆D。

2 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用3種動(dòng)物:雄性SD大鼠(260～280 g)、高脂飲食6個(gè)月的雄性C57BL/6小鼠以及雄性db/db基因型糖尿病小鼠。

3 方法

3.1 離體血管準(zhǔn)備 動(dòng)物吸入純CO2處死后，迅速取出胸主動(dòng)脈，并置于充有95%O2、5%CO2混合氣的低溫Krebs液(NaCl 119.0 mmol/L，NaHCO325.0 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgCl2·6H2O 1.0 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.5 mmol/L和葡萄糖11.0 mmol/L，pH7.4)液中，分離并去除血管周圍的結(jié)締組織及脂肪。將分離好的動(dòng)脈剪成約2 mm長(zhǎng)的血管環(huán)，將大鼠血管環(huán)通過2根細(xì)不銹鋼絲懸掛于器官浴槽(organ bath)內(nèi)，槽內(nèi)已預(yù)先放置10 mL Krebs液，持續(xù)通混合氣，并通過循環(huán)加熱系統(tǒng)使槽內(nèi)溶液溫度維持在37℃。將一根鋼絲固定于標(biāo)本架上，另一根鋼絲與張力換能器連接，平衡90 min后，調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力為2 g。將小鼠血管環(huán)輕輕移至Myograph系統(tǒng)的腔里，預(yù)先已放置5 mL Krebs液，持續(xù)通混合氣，并通過內(nèi)置加熱系統(tǒng)控制槽內(nèi)溶液溫度為37℃。血管環(huán)中穿入2根直徑為40 μm的不銹鋼絲，一根鋼絲固定于標(biāo)本架上，另一根與張力換能器連接，平衡90 min后調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力為5 mN。待血管平衡后，將Krebs液更換為6×10－2mol/L高鉀溶液，引發(fā)血管收縮以檢測(cè)血管收縮功能，然后沖洗、平衡3次。加入去氧腎上腺素 (3×10－7mol/L)，引發(fā)血管收縮，然后加入乙酰膽堿 (10－6mol/L)，血管舒張達(dá)到80%者，說(shuō)明內(nèi)皮功能完好，否則棄之不用。然后用新鮮Krebs液沖洗5次。

3.2 離體血管張力測(cè)定 待血管重新穩(wěn)定后給予血管收縮藥物去氧腎上腺素或者去氧腎上腺素加U46619引發(fā)血管收縮，進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。拮抗劑均在血管收縮藥物加入前30 min加入預(yù)孵。

3.3 免疫印跡 將血管組織勻漿，提取蛋白后用Lawry法測(cè)量蛋白濃度。取100 μg蛋白樣品上樣經(jīng)8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜，先加入鼠抗p－eNOSser11774℃ 孵育過夜;PBST清洗后在室溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgGⅡ抗孵育2 h;ECL化學(xué)發(fā)光法顯影，沖片。將同一張膜用stripping buffer(抗體去除液)孵育去除結(jié)合的抗體后，同法再檢測(cè)eNOS表達(dá)。

3.4 ELISA 將血管組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血管組織中PGF2α和TXB2的水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Rho激酶在血管內(nèi)皮依賴性舒張中的作用

在具備內(nèi)皮功能的離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)，用去氧腎上腺素(1×10－6mol/L)預(yù)收縮血管后，加入乙酰膽堿(10－8.5mol/L～10－5.5mol/L)引發(fā)劑量依賴性的血管舒張，見圖1A、E和表1。用去氧腎上腺素和U46619共同誘發(fā)血管收縮，待收縮達(dá)到平臺(tái)后，加入不同濃度的乙酰膽堿。與單獨(dú)去氧腎上腺素引起收縮時(shí)相比，乙酰膽堿的舒張血管作用大大減弱，與單獨(dú)去氧腎上腺素收縮組比較，P＜0.01，見圖1B、E和表1。但是，在本實(shí)驗(yàn)中我們沒有觀察到U46619明顯改變硝普鈉引起的血管舒張反應(yīng)，見圖1G。用Rho激酶抑制劑法舒地爾(1×10－5mol/L)預(yù)處理血管30 min后，再加入去氧腎上腺素和U46619引發(fā)血管收縮。待收縮穩(wěn)定后，加入不同濃度的乙酰膽堿，結(jié)果顯示，法舒地爾雖然未能顯著改變pD2值，卻有效地改善了乙酰膽堿的舒血管作用，最大舒張反應(yīng)(maximal effect，Emax)顯著增加(P ＜0.01)，見圖1C、F和表1。我們將NO通路用N－硝基－L－精氨酸甲酯(NG－nitro－L－arginine methyl ester，LNAME)阻斷后，再用法舒地爾預(yù)孵，觀察到法舒地爾改善血管舒張功能的作用消失，見圖1D、F和表1。

Figure 1.Effect of Rho kinase on endothelium－dependent vasorelaxation.A:acetylcholine(ACh)－induced relaxation in rat aortic rings pre－constricted by phenylephrine(Phe)as control;B:ACh－induced relaxation in rat aortic rings pre－constricted by Phe+U46619;C:the reduced ACh－induced relaxation in the presence of 100 nmol/L U46619 was partially reversed by treatment with 10 μmol/L fasudil;D:the reversed ACh － induced relaxation by fasudil was abolished by treatment with 100 μmol/L NG－nitro－L－arginine methyl ester(L－NAME);E:concentration－response curves for ACh in the absence and presence of 100 nmol/L U46619;F:concentration－response curves for ACh in rings with endothelium treated by fasudil or fasudil+L－NAME;G:concentration－response curves for sodium nitroprusside(SNP)in rings without endothelium.±sE.n=5～9.＊＊P＜0.01 vs control.圖1 Rho激酶對(duì)正常血管內(nèi)皮依賴性舒張的影響

2 Rho激酶對(duì)eNOS活性改變的影響

免疫印跡法對(duì)eNOS活性(eNOSser1177位點(diǎn)的磷酸化水平)的檢測(cè)結(jié)果見圖2。將大鼠主動(dòng)脈血管環(huán)在含有去氧腎上腺素的Krebs中預(yù)處理20 min后，加入乙酰膽堿孵育3 min，觀察到eNOS磷酸化程度均明顯增強(qiáng)，與單獨(dú)去氧腎上腺素處理的對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)。根據(jù)血管功能實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，同時(shí)用U46619和去氧腎上腺素預(yù)處理血管20 min后，再用乙酰膽堿刺激，則磷酸化eNOS的水平大大降低，與僅用去氧腎上腺素和乙酰膽堿的處理組相比差異顯著(P＜0.05)。這提示U46619對(duì)乙酰膽堿引起的eNOS磷酸化有抑制作用。圖2還顯示，U46619對(duì)eNOS磷酸化的這種抑制作用被提前30 min加入Rho激酶抑制劑Y27632部分翻轉(zhuǎn)。這些結(jié)果說(shuō)明在正常的大鼠血管，Rho激酶通過抑制eNOS磷酸化參與了血管的內(nèi)皮依賴性舒張功能的調(diào)節(jié)。

表1 乙酰膽堿誘發(fā)的血管最大舒張反應(yīng)和pD2值Table 1.pD2and Emaxvalues for acetylcholine－induced relaxation

3 Rho激酶對(duì)糖尿病血管舒張功能的影響

對(duì)db/db基因型糖尿病小鼠和高脂飲食小鼠血糖進(jìn)行測(cè)量，空腹血糖值均明顯升高(數(shù)據(jù)未顯示)。在db/db基因型糖尿病小鼠主動(dòng)脈血管環(huán)，我們觀察到乙酰膽堿引發(fā)的血管舒張作用受到明顯抑制，與C57BL/6的對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，提示內(nèi)皮功能紊亂，見圖3A。用Rho激酶抑制劑法舒地爾或Y27632預(yù)處理血管30 min后血管舒張功能明顯改善。因?yàn)闃颖緮?shù)有限，統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著差異，但結(jié)果表明藥物敏感性有所增強(qiáng)，最大舒張反應(yīng)也明顯增加，見圖3A、表1。在高脂飲食誘發(fā)的肥胖小鼠模型，我們也觀察到血管的內(nèi)皮依賴性舒張功能明顯減弱，最大舒張反應(yīng)顯著降低，與正常飲食的小鼠血管舒張反應(yīng)相比較差異顯著。Y27632預(yù)孵使血管舒張作用得到改善，見圖3B、表1，與高脂飲食組相比P＜0.01。

Figure 2.Effect of Rho kinase on phosphorylation of eNOS at Ser1177 in rat aortas.Aortic tissues were stimulated with phenylephrine(Phe)，Phe+acetylcholine(ACh)，U46619+Phe+ACh and Y27632+U46619+Phe+ACh in normal Krebs solution.±sE.n=3.*P ＜0.05 vs Phe;#P ＜0.05 vs Phe+ACh;△P ＜0.05 vs U46619+Phe+ACh.圖2 Rho激酶對(duì)正常血管eNOS磷酸化水平的影響

Figure 3.Effects of Rho kinase inhibitors(fasudil and Y27632)on endothelium－dependent vascular relaxation in diabetic db/db mice(A)and mice fed with high－fat diet(HFD)(B).Phe:phenylephrine.±sE.n=5～9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖3 Rho激酶抑制劑對(duì)基因型糖尿病小鼠和高脂飲食肥胖小鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張的影響

4 血管組織中PGF2α和TXB2水平測(cè)定

用ELISA試劑盒對(duì)基因型糖尿病小鼠血管組織中TP受體激活物(PGF2α和TXB2)進(jìn)行測(cè)量，二者水平比對(duì)照組(C57BL/6小鼠)明顯升高(均 P＜0.05)，見圖 4。

Figure 4.Levels of PGF2α(A)and TXB2(B)in aortas of diabetic db/db mice.±sE.n=4.*P＜0.05 vs non－diabetic vessels.圖4 糖尿病小鼠血管組織中TP受體激活物的水平

討 論

TXA2是一類前列腺素類的代謝產(chǎn)物，由花生四烯酸在環(huán)氧合酶的作用下生成。在諸多生理和病理性的刺激下，TXA2生成增多，通過TP受體激活Rho激酶。本研究表明，Rho激酶激活可以降低正常血管eNOS的活性進(jìn)而抑制血管的內(nèi)皮依賴性舒張;抑制Rho激酶可以改善糖尿病動(dòng)物的血管內(nèi)皮功能紊亂。

Rho激酶以2種異構(gòu)體形式存在:ROKα和ROKβ，也稱作 ROCK － II和 ROCK － I［1］，廣泛存在于各種組織中。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，Rho激酶的激活介導(dǎo)了多種血管功能發(fā)生異常改變的機(jī)制，不僅引起“鈣敏感化”使平滑肌收縮［2，7－8］，還可以抑制NO 的產(chǎn)生［6，9－10］，從而影響血管的功能。U46619 是TXA2的擬似物，是用來(lái)激活TP受體的常用工具藥。Y27632和法舒地爾(fasudil，HA1077)是最常用的Rho激酶抑制劑。前者為吡啶類衍生物的二鹽酸鹽，以載體介導(dǎo)的易化擴(kuò)散方式被細(xì)胞攝取，在細(xì)胞中作用于Rho激酶催化結(jié)構(gòu)域的ATP結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制Rho激酶，對(duì)ROCK I和 ROCK II抑制的Ki值分別為0.22 μmol/L 和0.30 μmol/L。后者是一種新型異喹啉磺酰胺衍生物類藥物，已經(jīng)作為Rho激酶抑制劑廣泛用于改善和預(yù)防蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣及引起的腦缺血癥狀［11］。本研究結(jié)果表明，U46619明顯抑制血管的內(nèi)皮依賴性舒張。Rho激酶是TP受體下游的主要靶點(diǎn)，我們考慮U46619對(duì)血管功能的抑制作用可能與Rho激酶激活有關(guān)。如果是的話，用Rho激酶抑制劑阻斷該通路應(yīng)該能有效地改善血管的舒張功能;因?yàn)樵趪X類動(dòng)物的主動(dòng)脈，乙酰膽堿的血管內(nèi)皮依賴性舒張作用主要是通過NO介導(dǎo)的，那么，在阻斷NO產(chǎn)生的情況下，Rho激酶抑制劑將不能改善血管舒張。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了我們的假設(shè):在用Y27632和法舒地爾抑制Rho激酶激活的情況下，血管的內(nèi)皮依賴性舒張作用得到明顯改善;但是，這一作用被L－NAME(eNOS抑制劑)所抵消。這與我們前期對(duì)cAMP介導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性血管舒張作用進(jìn)行研究的結(jié)果相一致［6］。U46619抑制了乙酰膽堿引起的eNOS磷酸化，這一作用被抑制Rho激酶所翻轉(zhuǎn)。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，U46619減弱乙酰膽堿舒張血管的作用很可能與Rho激酶激活抑制eNOS的磷酸化從而降低eNOS活性使NO生成減少有關(guān)。

大量資料都表明Rho激酶激活在高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病中起著重要作用［12－13］。因?yàn)閮?nèi)皮功能損傷被認(rèn)為是糖尿病血管功能發(fā)生改變的一個(gè)主要環(huán)節(jié)，我們選用了基因型和肥胖型糖尿病疾病模型，對(duì)糖尿病狀態(tài)下Rho激酶是否影響血管內(nèi)皮功能進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)在血管離體狀態(tài)下，抑制Rho激酶改善了糖尿病動(dòng)物血管的內(nèi)皮功能。這提示糖尿病血管病變可能與Rho激酶激活有關(guān)。考慮到Rho激酶是TP受體激活的下游分子，PGF2α和TXB2(TXA2的代謝物)均為 TP受體的配體［7］，我們觀察到糖尿病動(dòng)物血管組織中PGF2α和TXB2水平顯著升高，這為糖尿病狀態(tài)下Rho激酶激活提供了直接依據(jù)。

綜上所述，TP受體激活可以通過增強(qiáng)Rho激酶活性影響正常血管的內(nèi)皮功能，糖尿病狀態(tài)下血管內(nèi)皮功能紊亂與TP受體激活物合成增多、Rho激酶活性增強(qiáng)和eNOS活性降低有關(guān)。抑制TP受體激活或抑制Rho激酶活性可能會(huì)對(duì)糖尿病血管內(nèi)皮功能損傷起到預(yù)防或治療作用。利用TP受體阻斷劑或Rho激酶抑制劑對(duì)糖尿病模型動(dòng)物進(jìn)行慢性處理，觀察心血管系統(tǒng)功能的改變是我們下一步研究的內(nèi)容。

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