miR-205對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞增殖、黏附和遷移的影響及機(jī)制探討

孫慧娟，胡純婷，吳共發(fā)

(1中山市阜沙醫(yī)院，廣東中山510632;2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;3中山大學(xué)附屬博濟(jì)醫(yī)院)

黑色素瘤是皮膚癌中最具侵襲性的腫瘤。雖然近年來檢查手段及治療方法均有進(jìn)步，但死于黑色素瘤的人數(shù)約占所有因皮膚癌死亡人數(shù)的70%，且惡性黑色素瘤患者5年生存率只有15%，目前對(duì)黑色素瘤的治療還是缺乏有效的方法。近年來微小RNA(miRNA)在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越被人們重視。2011年11月～2012年4月，我們通過研究miR-205對(duì)黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及可能機(jī)制，探討黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人類皮膚惡性黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，總RNA提取試劑盒——RNAisoTMPLUS購自日本TaKaRa公司; miRNA qRT-PCR試劑盒購自美國GeneCopoeiaTM公司;miR-205的引物及內(nèi)參U6的引物由杰特偉公司設(shè)計(jì)合成;miR-205 mimics及對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照由上海吉瑪公司設(shè)計(jì)并合成;胎牛血清及RPMI 1640培養(yǎng)基、陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000及Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司;Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購自日本同仁化學(xué)有限公司;纖維連接蛋白購自美國Sigma公司;小牛血清白蛋白購自華美生物工程公司;多克隆兔抗人PTEN、p-AKT(ser473)、AKT為美國Bioworld產(chǎn)品;多克隆兔抗人β-actin為美國Santa Cruz Biotechnology產(chǎn)品;抗體稀釋液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、ECL反應(yīng)檢測(cè)試劑盒、總蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù);蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、胰酶購自南京凱基公司; PVDF膜為美國Millipore產(chǎn)品;辣根酶標(biāo)記抗兔IgG購自北京中杉金橋公司。各種規(guī)格培養(yǎng)板購自美國Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 待培養(yǎng)瓶中的A375細(xì)胞生長狀態(tài)良好，鋪滿瓶壁90%時(shí)，胰酶消化細(xì)胞，吹打，制備成細(xì)胞懸液，3.0×105/孔的細(xì)胞數(shù)鋪6孔板，鋪板后20 h，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-205表達(dá)，轉(zhuǎn)染方法按照說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染miR-205 mimics的細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染 miR-205 mimics negative control的細(xì)胞為陰性對(duì)照組，另設(shè)置不做任何處理的細(xì)胞為空白對(duì)照組。轉(zhuǎn)染48 h收集細(xì)胞RNA檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及收集蛋白用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 細(xì)胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照說明書進(jìn)行，熒光定量PCR反應(yīng)體系為:2×All-in-OneTMQ-PCR Mix 10 μL，All-in-OneTMmiRNA Q-PCR Primer(2 μmol/L)2 μL，Universal Adaptor PCR Primer(2 μmol/L)2 μL，1ststrand cDNA (diluted 1∶5)2 μL，RNase/DNase free ddH2O 4 μL，終體積20 μL。在PCR反應(yīng)管中充分混勻反應(yīng)體系，短暫離心，置入ABI 7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，檢測(cè)熒光信號(hào);溶解曲線分析:95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s，60℃ 15 s。以Folds=2－ΔΔCt表示目的miRNA在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中表達(dá)的倍比關(guān)系，采用如下計(jì)算公式:ΔΔCt=［Ct(miRNA)－Ct (U6)］實(shí)驗(yàn)組－［Ct(miRNA)－Ct(U6)］對(duì)照組，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。陰性對(duì)照組為對(duì)照組，其余2組與之進(jìn)行比較，

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖變化 細(xì)胞0.5×104/孔均勻接種于96孔板，終體積100 μL/孔，每組6個(gè)復(fù)孔，鋪板后20 h轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h，每孔加10 μL CCK-8，置37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱避光孵育2 h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm測(cè)定吸光度值(OD值)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔取平均值。

1.2.4 細(xì)胞黏附能力檢測(cè) 將濃度為50 μg/mL的纖維黏連蛋白75 μL加入96孔培養(yǎng)板中，用37℃預(yù)熱的PBS小心沖洗2次，加入10 g/L緩沖液稀釋的小牛血清白蛋白(100 μL/孔)，以封閉非特異性位點(diǎn)。PBS沖洗2次，3組細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，濃度均為1×105/mL，以100 μL/孔的量將腫瘤細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中置37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。培養(yǎng)結(jié)束后，倒置顯微鏡觀察，之后緩慢吸出培養(yǎng)液，PBS沖洗未黏附的細(xì)胞2次，加入含2%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基200 μL，每孔加20 μL CCK-8，置37℃，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱避光孵育2 h后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于450 nm測(cè)定OD值，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔取平均值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 預(yù)先在6孔板板底作3條標(biāo)記線，細(xì)胞轉(zhuǎn)染18 h后，取出6孔板，用10 μL移液器槍頭輕輕地沿直尺垂直于標(biāo)記線呈“丨”劃過板底，PBS清洗細(xì)胞2次以洗去漂浮細(xì)胞，然后換上2%的胎牛血清培養(yǎng)基，減少細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響。在劃痕后的不同時(shí)間點(diǎn)拍照，動(dòng)態(tài)觀察3組細(xì)胞的遷移情況。

1.2.6 Western blot檢測(cè) 轉(zhuǎn)染48 h時(shí)PBS洗細(xì)胞3次，細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下離心收集，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩０慈鞍滋崛≡噭┖姓f明書提取蛋白并測(cè)蛋白濃度，每泳道加40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，印跡膜在含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液內(nèi)室溫封閉1 h，加入一抗(PTEN、磷酸化 AKT、AKT、β-actin稀釋度分別為1∶500、1∶200、1∶1 000、1∶1 000)4℃過夜孵育，洗膜，加人辣根酶標(biāo)記抗兔IgG(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，β-actin為內(nèi)對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，轉(zhuǎn)染效率采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，其余數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA分析，多重比較采用LSD法，方差不齊則采用Dunnett＇s法，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-205上調(diào)效率 實(shí)驗(yàn)組miR-205表達(dá)是陰性對(duì)照組的(213.770±12.577)倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=29.301，P=0.000)，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間miR-205表達(dá)無顯著差異(t=－0.804，P=0.506)，說明在A375細(xì)胞中成功上調(diào)miR-205表達(dá)。

2.2 細(xì)胞增殖變化 實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組OD值分別為0.748±0.083、1.241±0.057、1.225±0.054，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 139.007，P=0.000)。實(shí)驗(yàn)組OD值較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組均減少(P=0.000，P=0.000)，而后2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.305)。說明上調(diào)miR-205的表達(dá)能減低A375細(xì)胞的增殖能力。

2.3 各組細(xì)胞黏附能力的改變 實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組OD值分別為0.29±0.24、0.58± 0.32、0.59±0.21，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F= 166.349，P=0.000)。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組的黏附能力減低(P＜0.05)。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在A375細(xì)胞上調(diào)miR-205表達(dá)后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在36 h和60 h時(shí)間點(diǎn)的劃痕愈合程度均低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，后兩者的劃痕愈合程度無顯著差別，見插頁Ⅰ圖6。

2.5 Western blot結(jié)果 在A375細(xì)胞上調(diào)miR-205表達(dá)后，PTEN蛋白表達(dá)增加，磷酸化AKT蛋白表達(dá)減少，但對(duì)非磷酸化的AKT蛋白沒有影響，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組各蛋白表達(dá)均無差異，見圖1。

圖1 miR-205對(duì)PTEN/AKT通路蛋白影響

3 討論

黑色素瘤是一種高度惡性腫瘤，常見于皮膚，其進(jìn)展迅速，極易轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后極差，嚴(yán)重危害人類健康。黑色素瘤的發(fā)生經(jīng)歷一個(gè)多步驟的過程，包括從正常色素細(xì)胞—色素痣—原位癌—擴(kuò)大生長—浸潤生長。在對(duì)黑色素瘤分子形成機(jī)制的大量研究中，miRNA起著至關(guān)重要的作用。目前關(guān)于miRNA在黑色素瘤中的作用相比于其他腫瘤的報(bào)道較少，且大部分研究來源于其他腫瘤。miRNA是一類廣泛存在于真核生物中，大小約21～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，它通過與靶基因mRNA特異性結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解或蛋白質(zhì)翻譯的抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與生物復(fù)雜生命過程的調(diào)控。已證實(shí)miRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要角色。

miR-205是在多種物種間高度保守的一個(gè)miRNA，2007年被證實(shí)存在于人類［1］。隨后研究證實(shí)miR-205在多種腫瘤中起抑癌基因的作用，在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，通過恢復(fù)其表達(dá)后，能抑制腫瘤細(xì)胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移［2～4］。在黑色素瘤中，過表達(dá)miR-205能抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖、多克隆形成和動(dòng)物體內(nèi)腫瘤形成等，被認(rèn)為是黑色素瘤的抑癌基因，并且miR-205通過調(diào)節(jié)AKT磷酸化水平影響細(xì)胞增殖能力［5］。在小鼠乳腺上皮細(xì)胞中，已證實(shí)抑癌基因PTEN是小鼠miR-205的靶基因［6］。PTEN是否為人類miR-205的直接靶基因未見文獻(xiàn)報(bào)道。我們通過多種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)(http:// www.targetscan.org/，http://www.microrna.org/microrna/home.do，http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/)，PTEN是人miR-205的潛在靶基因。這可能與miR-205在多個(gè)物種間具有高度保守性有關(guān)。雖然miR-205通過調(diào)控AKT通路活性影響黑色素瘤細(xì)胞增殖［5］，但黑色素瘤中miR-205與PTEN/AKT通路之間的關(guān)系未見報(bào)道。

本研究通過在人皮膚黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染上調(diào)miR-205，觀察細(xì)胞增殖、黏附、遷移能力的變化及PTEN/AKT通路之間的關(guān)系，進(jìn)一步闡明黑色素瘤的病因機(jī)制。研究結(jié)果顯示，上調(diào)miR-205表達(dá)后細(xì)胞增殖、黏附和遷移能力均顯著減低，而Western blot結(jié)果顯示上調(diào)miR-205表達(dá)能增加PTEN蛋白表達(dá)，減低磷酸化AKT蛋白水平，但對(duì)非磷酸化的AKT蛋白表達(dá)無影響。PTEN是公認(rèn)的腫瘤抑制基因，它通過對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化水平的精細(xì)調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞生長、增殖、分化、凋亡、黏附和遷移等重要生物學(xué)行為。大量研究證實(shí)PTEN通過干擾一些信號(hào)通路能控制腫瘤細(xì)胞生長，抑制腫瘤黏附和遷移［7］。PTEN能使PI3K的3-磷酸化位點(diǎn)去磷酸化和負(fù)向調(diào)節(jié)AKT信號(hào)通路，使AKT磷酸化水平下降，已知AKT信號(hào)通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞存活、增殖和運(yùn)動(dòng)能力［8，9］，其磷酸化水平即活性減低能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲轉(zhuǎn)移能力。結(jié)合本研究結(jié)果，提示在黑色素瘤中，上調(diào)miR-205能減弱腫瘤細(xì)胞增殖、黏附和遷移能力，這些生物學(xué)行為的改變時(shí)通過調(diào)控增強(qiáng)PTEN蛋白和減低AKT活性水平介導(dǎo)實(shí)現(xiàn)的。但由于miRNA具有廣泛生物學(xué)調(diào)控功能，miR-205影響黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究。

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