甜茶中鞣花酸抗過敏性實驗研究

薛茗月，羅星曄，湛志華，陳全斌

（1.桂林師范高等?？茖W(xué)?；瘜W(xué)與工程技術(shù)系，廣西桂林541001；2.桂林環(huán)保局，廣西桂林541003；3.廣西師范大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，廣西桂林541004）

甜茶（Rubus Suavissmus S.Lee，Sweet Tea），是薔薇科懸鉤子屬植物的一個品種、廣西的特產(chǎn)[1]。主產(chǎn)于廣西的柳州、桂林、梧州等地區(qū)，甜茶具有祛痰止咳、清熱、潤肺等功效，廣泛用于保健品、食品和化妝品等領(lǐng)域中[2]。有關(guān)研究表明，鞣花酸具有多種生物活性功能，例如抗氧化功能、抗癌[3]、抗突變性能[4]、能抑制人體免疫缺陷病毒（HIV）的增生[5]；鞣花酸還是一種有效的凝血劑[6]，對多種細(xì)菌、病毒都有很好的抑制作用，能防止感染抑制潰瘍[7]。除此之外，鞣花酸還具有降壓、鎮(zhèn)靜，預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種生理作用[8]。鞣花酸作為一種新型的藥物原料和食品添加劑日益受到人們的重視。李小萍[9]，貝玉祥[10]，周本宏[11]、王予祺等[12]分別對對紅樹莓果、訶子、石榴皮和蛇莓中的鞣花酸含量進(jìn)行了測定，其中訶子中鞣花酸含量最高，達(dá)到了573 mg/kg；李小萍等[13]研究了紅樹莓果重鞣花酸的抗氧化性研究，發(fā)現(xiàn)莓果中的鞣花酸提取物具有較強的還原能力。因此，開展甜茶中鞣花酸的研究，對甜茶植株的化學(xué)成分分布、開發(fā)甜茶系列產(chǎn)品、甜茶的推廣應(yīng)用具有重大意義。近年來，甜茶的研究越來越受到重視，但重點均局限于對甜茶素[14]、黃酮苷[1]及其苷元[14]的提取和測定，甜茶粗體物藥理[15]的研究，而對甜茶中鞣花酸的研究鮮見報道。因此，本文對甜茶中鞣花酸進(jìn)行抗過敏的研究，為開發(fā)以甜茶為原料的保健品、天然抗過敏性藥物提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 試劑

甲醇（CP）、蒸餾水、無水Na2SO4、石油醚（AR）、氯仿（CP）、乙酸乙酯（CP）、95%工業(yè)酒精、無水Na2SO4。

撲爾敏（批號：070504），廣東南國藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；磷酸組織胺（批號：0609015）：中科院上海生化所東風(fēng)生化技術(shù)公司產(chǎn)品；醫(yī)用天花粉：市售。4%（g/g）氫氧化鋁凝膠（批號：060308）：廣西南寧制藥企業(yè)集團(tuán)公司產(chǎn)品；鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma-Aldrich 公司；LSA-10大孔吸附樹脂：西安藍(lán)深交換吸附材料有限責(zé)任公司。

1.2 儀器

722 型光柵分光光度計：上海分析儀器三廠產(chǎn)品；中試型智能控制連續(xù)化多功能超聲波提取組GDCTQ/ZS/3：濟(jì)寧金百特電子有限責(zé)任公司制造。

1.3 動物

昆明種小鼠，體重18 g～22 g，雌雄各半，清潔級（合格證號：SCXK 桂2003-0003）：廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。小鼠分性別飼養(yǎng)于空調(diào)實驗室內(nèi)，室溫：（22±2）℃，相對濕度：（60±2）%，喂顆粒標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水和攝食。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

實驗所得數(shù)據(jù)采用PEMS3.1 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，各試驗組與對照組之間采用t 檢驗進(jìn)行比較。

1.5 鞣花酸的制備

取甜茶根2 kg，碾碎后置入40 L 超聲波提取罐，加20 L 水，加熱至80 ℃，超聲提取1 h，膜過濾，重復(fù)一次，合并濾液，濃縮，濾液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，萃取液用無水Na2SO4脫水，再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收部分溶劑，放置，乙酸乙酯萃取液得到黃色顆粒結(jié)晶，堿溶酸沉，經(jīng)水洗、醇洗后，紅外干燥儀中干燥，得黃色顆粒結(jié)晶化合物A（約2.0 g）。

2 鞣花酸的鑒定

采用KBr 壓片法，在波數(shù)為4 000 cm-1～400 cm-1范圍分別對鞣花酸對照品（標(biāo)準(zhǔn)樣品）和樣品A 進(jìn)行掃描，其譜圖見圖1。

鞣花酸標(biāo)樣的主要吸收峰[IR（KBr）/cm-1]：3 555，1 698，1 621，1 582，1 511，1 448，1 390，1 335，1 259，1195，1115，1059，922，882，758。其中3555cm-1為O-H伸縮振動頻率，1 698 cm-1為C=O 的伸縮振動頻率，1 621，1 582，1 511，1 448 是苯的C=C 伸縮振動峰。

樣品A 的主要吸收峰[IR（KBr）/ cm-1]：3 559，1 695，1 618，1 582，1 511，1 451，1 395，1 346，1 257，1 195，1 111，1 056，922，882，757。樣品A 與鞣花酸對照品的紅外譜圖譜峰的重合性較好，各峰波數(shù)基本一致，并與文獻(xiàn)[13]相符。因此，制備得到的黃色顆粒結(jié)晶物A 為鞣花酸。

3 鞣花酸抗過敏對比試驗

3.1 對小鼠被動皮膚過敏試驗[16]

抗原：醫(yī)用天花粉。佐劑：4%氫氧化鋁凝膠。臨用時用0.01 g 天花粉溶于4 mL 氫氧化鋁凝膠中。致敏，健康小鼠10 只，體重18 g～22 g，將上述天花粉氫氧化鋁凝膠混懸液腳掌注射，兩只后腳掌各注入0.05mL，共注射0.1 mL。15 d 后，斷頭取血，離心取抗血清備用。

被動皮膚過敏：另取小鼠60 只，體重18 g～22 g，雌雄各半。隨機(jī)分為正常對照組，撲爾敏（4 mg/kg）組，鞣花酸大小劑量（200、100 mg/kg）組，每組10只。每天灌胃給藥1 次，正常對照組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給予5 d。取上述血清（10 只致敏小鼠的混合抗血清）加生理鹽水稀釋成1 ∶5，每只鼠腹壁皮內(nèi)注射兩個點（相距0.2 cm），每點0.03 mL。并再連續(xù)給藥2 d，于末次給藥12 h 后，每只小鼠進(jìn)行抗原攻擊，尾靜脈注射天花粉（2.5 mg/mL，用1%伊文思藍(lán)-生理鹽水配制）0.2 mL/只，20 min 后處死動物，剪下腹部藍(lán)斑皮膚（0.5 g），剪碎，浸泡于丙酮生理鹽水溶液（7 ∶3）5 mL 中48 h，離心（3 000 r/min）15 min 取上清液，用分光光度計于610 nm波長處測定吸收度（OD），并作組間比較，評價藥物的抗過敏作用，結(jié)果見表1。

表1 鞣花酸對小鼠被動皮膚過敏反應(yīng)的影響Table 1 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Leeon the passive skin allergy of mice

結(jié)果表明，鞣花酸樣品和陽性藥撲爾敏能顯著抑制小鼠被動皮膚通透性，減少腹部藍(lán)斑皮膚浸出液的光密度值，提示鞣花酸樣品具有很強的抗皮膚過敏作用，強弱對比順序如下：鞣花酸樣品＞撲爾敏。

3.2 對組胺致小鼠毛細(xì)血管通透性增高的作用[17]

取小鼠60 只，雌雄各半，隨機(jī)分為正常對照組，撲爾敏（4 mg/kg）組，鞣花酸大小劑量（200、100 mg/kg）組，每組10 只。每天灌胃給藥1 次，正常對照組給予等體積蒸餾水，連續(xù)給予5 d。于末次給藥30 min 后，腹部皮內(nèi)注射組胺10 μg/mL，形成一小皮丘，立即尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)0.0l mL/g，30 min 后處死動物，用直徑0.8 cm 的打孔器打下兩片藍(lán)染皮片，放入3 mL生理鹽水-丙酮（3 ∶7）混合液中，在37 ℃恒溫水浴鍋中放置24 h，浸出液離心，取上清液，用721 型分光光度計（610 nm）測吸光度，結(jié)果見表2。

表2 鞣花酸對組胺致小鼠毛細(xì)血管通透性增高的影響Table 2 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on mice which induced increase of capillary permeability by histamine

結(jié)果表明，鞣花酸大小劑量組均能明顯減少大鼠藍(lán)斑皮膚的光密度值，顯示抑制組胺致小鼠毛細(xì)血管通透性增高，提示鞣花酸對組織胺引起的皮膚毛細(xì)血管通透性的過敏反應(yīng)具有很強的抑制作用。

3.3 對二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)的影響[18]

取小鼠60 只，雌雄各半。隨機(jī)分為正常對照組，撲爾敏（4 mg/kg）組，鞣花酸大小劑量（200、100 mg/kg）組，每組10 只。各組小鼠腹部用電推剪去毛（3×3 cm），用1%2，4-二硝基氯苯（DNCB）丙酮液50 μL 涂于小鼠腹腔皮膚致敏，致敏前一天灌胃給藥，連續(xù)9 d，致敏后7 d 以1%DNCB 涂右耳攻擊，24 h 后脫頸椎處死，剪取左右耳相同部位，用直徑為8 mm 的打孔器打下圓耳片稱重，以兩耳片重量差值（腫脹度）為指標(biāo)，評價藥物的抗過敏反應(yīng)。結(jié)果見表3。

表3 鞣花酸對二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)的影響（x±s）Table 6 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on the skin allergy which caused by the impact of dinitrochlorobenzene delayed

結(jié)果表明，鞣花酸大小劑量組均能明顯減少二硝基氯苯致敏小鼠耳朵重量，減少腫脹度，提示其對二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏具有很強的抑制作用。

3.4 磷酸組織胺引起的豚鼠致癢反應(yīng)模型的影響[18-19]

取60 只豚鼠，體重350 g～500 g，雌雄各半，隨機(jī)分為正常對照組，陽性藥撲爾敏（4 mg/kg）組，鞣花酸大小劑量（200、100 mg/kg）組，每組10 只。于實驗前1 h 剪去右后腿部毛并用砂紙擦傷皮膚，面積約2 cm2。各組給藥或生理鹽水30 min 后，用0.05%磷酸組織胺50 μL，涂抹擦傷皮膚，3 min 內(nèi)豚鼠如不出現(xiàn)舔擦傷皮膚動作，再涂抹一次組織胺，如此重復(fù)操作，直至出現(xiàn)為止，記錄涂抹組織胺次數(shù)及累積用量，結(jié)果見表4。

表4 鞣花酸對組織胺所致豚鼠皮膚致癢的影響（x±s）Table 4 The effect of ellagic acid and crude extracts of Rubus Suavissimus S.Lee on the itch skin of guinea pig which caused by histamine

結(jié)果表明，鞣花酸大小劑量組均能明顯增加涂抹豚鼠組織胺次數(shù)及累積用量，提示其具有明顯抑制磷酸組織胺引起的豚鼠致癢作用。

4 結(jié)果與討論

研究表明，被動皮膚過敏是由Ig E 類抗體所介導(dǎo)而引起的I 型變態(tài)反應(yīng)性病癥，其臨床常見疾病有過敏性休克、支氣管哮喘、過敏性鼻炎、蕁麻疹等。小鼠同種被動皮膚過敏試驗，是小鼠致敏后用同種抗原攻擊，可引起肥大細(xì)胞脫顆粒，釋放過敏介質(zhì)（組織胺、慢反應(yīng)物質(zhì)、5-羥色胺等），使皮膚局部血管的通透性增加，在抗原攻擊的同時加入伊文思藍(lán)染料，根據(jù)局部皮膚染料滲出的多少，判斷血管通透性的變化，為篩選抗過敏作用藥物的有效方法。皮內(nèi)注射過敏介質(zhì)（如組織胺），使皮膚局部血管的通透性增加，同時靜脈給予伊文思藍(lán)，用比色法測定，根據(jù)染料的通透量反映毛細(xì)血管通透性大小，可直接反應(yīng)出藥物是否有拮抗過敏介質(zhì)的作用。

鞣花酸能顯著降低被動皮膚過敏小鼠皮膚藍(lán)斑的光密度值；以及能明顯拮抗過敏介質(zhì)組織胺所致的小鼠毛細(xì)血管通透性增加；明顯抑制二硝基氯苯所致遲發(fā)型皮膚過敏反應(yīng)；抑制磷酸組織胺引起的豚鼠致癢反應(yīng)。綜上所述，鞣花酸在多種致敏動物模型實驗中證實，具有顯著的抗過敏作用，為鞣花酸進(jìn)一步的研究與開發(fā)提供了實驗參考。

[1] 陳全斌,張巧云,義祥輝.高純度甜茶甙的制備[J].林業(yè)科技,2006,31(4):55-56

[2] 溫桂清,陳全斌,林霜.火焰原子吸收光譜法測定廣西甜茶中的微量元素[J].化工時刊,2008,22(10):51-52

[3] Osawa T,Ide A,Su J D,et al.Inhibition of lipid peroxidation,by ellagic acid[J].J Agr Food Chem,1987,35(5):808-812

[4] Su J D,Osawa T,Kawakishi S,et al. Tannin antioxidants from Osbeckia chinemsis[J].Phytochemistry,1988,27(5):1315-1319

[5] Chemeng K A,Schwender C F,Fu K P,et al. DNA gyrase inhibitory and antibacterial activity of some flavones(1)[J].Vioorg Med Chem Lett,1993,3(2):225-230

[6] Asami Y,Ogura T,Otake N,et al. Isolation and synthesis of a new bioactive ellagic acid derivative from combretum yunnanensis[J].J Nat Prod,2003,66(5):729-731

[7] 姜成哲,張乾坤,金慶日,等.鞣花酸對脾淋巴細(xì)胞增殖、自然殺傷細(xì)胞活性和Th1/Th2 細(xì)胞因子的影響[J].中草藥,2010,41(2):275-277

[8] 丁運生,孫小虎,李有桂,等.鞣花酸及其衍生物研究進(jìn)展[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,31(11):1809-1812

[9] 李小萍,梁琪,辛秀蘭,等.高效液相色譜法測定紅樹莓中鞣花酸含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(24):11345-11346

[10] 貝玉祥,楊陽,郭英,等.高效液相色譜法測定訶子中鞣花酸的含量[J].時珍國醫(yī)國藥,2009,20(9):2178-2179

[11] 周本宏,吳振華,李小軍,等.高效毛細(xì)管電泳法測定石榴皮中鞣花酸的含量[J].藥品檢驗,2005,16(24):1893-1894

[12] 王予祺,斯建勇,劉新民,等.蛇莓中鞣花酸和短葉蘇木酚羧酸的分離鑒定及含量測定[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2008,20(4):667-671

[13] 李小萍,梁琪,辛秀蘭,等.紅樹莓果中鞣花酸提取物的抗氧化性研究[J].提取物與應(yīng)用,2010,35(5):182-185

[14] 陳全斌,沈鐘蘇,張巧云,等.甜茶中黃酮甙元的分離提純及其表征[J].林業(yè)科技,2005,30(1）：46-48

[15] 謝瑩，陳全斌，羅達(dá)偉,等.高純度甜茶甙對四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖的影響[J].陜西中醫(yī),2010,31(3):367-368

[16] 徐叔云.藥理實驗方法學(xué)[M].3 版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2002：1409-1412

[17] 李靜平,李慶生,陳海豐,等.膚敏水煎劑抗過敏的實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2005,16(3):182-185

[18] 黃俊,謝金鮮.鼻炎膏抗炎抗過敏的實驗研究[J].廣西中醫(yī)藥,2001,24(1):57-59

[19] 宋光熠,張一紅,李杰,等.消風(fēng)止癢顆粒劑藥理作用的實驗研究[J].中成藥,1995,17(12):30-32