HPLC法測定新疆羅布麻茶中的蘆丁和槲皮素

王省超，王瑞英，*，孫穎，張?zhí)┌祝瑥堼堁?/p>

（1．新疆大學(xué)理化測試中心，新疆烏魯木齊830046；2．新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆烏魯木齊830004；3．新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆烏魯木齊830046）

羅布麻又名野麻、茶葉花，分為紅麻和白麻兩種，是屬夾竹桃科多年生的半灌木，主要生長在沙漠鹽堿地、河岸、山溝的砂質(zhì)地，盛產(chǎn)于我國西北區(qū)域，如新疆、甘肅、青海和寧夏等多個(gè)省市區(qū)。因最早發(fā)現(xiàn)在新疆羅布泊，故名為羅布麻[1]。大量研究表明，羅布麻的主要化學(xué)成分為黃酮類化合物、氨基酸、脂肪酸醇酯及多種礦物質(zhì)元素等[2-4]，其中，黃酮類化合物主要分布在羅布麻葉中。羅布麻茶是由羅布麻葉干燥后經(jīng)傳統(tǒng)制茶工藝制成。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物對(duì)改善血液循環(huán)、預(yù)防和治療高血壓、降血脂、平肝安神、抑菌延衰抗氧化等方面具有顯著作用[5-9]。羅布麻茶中的黃酮類化合物以蘆丁、槲皮素等為主，因而測定羅布麻茶中蘆丁和槲皮素的含量具有重要意義。

本文以新疆羅布麻茶為研究對(duì)象，提取該茶中的蘆丁和槲皮素，建立高效液相色譜法對(duì)其含量同時(shí)進(jìn)行分析，并初步探討提取方法、提取溫度、提取溶劑及料液比對(duì)蘆丁和槲皮素含量的影響，以期為羅布麻的進(jìn)一步研究與開發(fā)應(yīng)用提供一定的參考。

1 儀器與材料

Agilent 1100 型高效液相色譜系統(tǒng)，四元梯度泵，真空脫氣機(jī)，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱，二極管陣列檢測器及Agilent 化學(xué)工作站；KHS200 超聲波清洗器：江蘇昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；RT-205 型電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；Millpore 超純水器：美國，Millpore 公司。

蘆丁和槲皮素對(duì)照品均購自中國藥品生物制品檢定所；羅布麻茶購于新疆烏魯木齊市濟(jì)康大藥房；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液

分別精密稱量對(duì)照品適量，用色譜純甲醇溶解、定容至25 mL 的容量瓶中，分別配制成含蘆丁0.342 mg/mL 和槲皮素0.124 mg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 對(duì)照品溶液

精密吸取1 mL 蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液和2 mL 槲皮素對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于10 mL 的容量瓶中，用色譜純甲醇定容，配制成含蘆丁0.034 2 mg/mL 和槲皮素0.024 8 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液

精密稱取羅布麻茶粉末（過70 目篩）3 g，置于50 mL圓底燒瓶中，加入45 mL 70 %的乙醇溶液，超聲提取2 h，定容至50 mL 的容量瓶中，經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾后，用于HPLC 分析。

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18（150×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸水溶液（40∶60，體積比）；流速為1.0 mL/min，檢測波長360 nm，柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。在該色譜條件下，對(duì)照品蘆丁和槲皮素分離較好（如圖1），對(duì)于供試品，盡管羅布麻茶中成分較多，蘆丁和槲皮素在該色譜條件下仍然實(shí)現(xiàn)了良好分離，滿足定量分析需要（如圖2）。

2.3 線性關(guān)系考察

按“2.2”色譜條件，分別將對(duì)照品溶液依次進(jìn)樣1、2、4、8、12、16、20 μL，以Y（AV·S）為峰面積，X（μg）為進(jìn)樣質(zhì)量，蘆丁和槲皮素的方程分別為：Y=879.399 6X+2.891 9，r=1.000 00；Y=952.703 0X-2.003 9，r=0.999 90。結(jié)果表明，蘆丁在0.0342 μg～0.684 μg 和槲皮素在0.0248 μg～0.496 μg 間呈良好線性關(guān)系（圖3）。

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

取上述對(duì)照品溶液進(jìn)樣，每次10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測定峰面積，蘆丁和槲皮素的RSD 分別為0.45%和0.80%（n=5），表明本方法精密度良好。

2.5 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一羅布麻茶樣品5 份，按“2.1.3”方法制備供試溶液，在“2.2”色譜條件下分別測定蘆丁和槲皮素含量，其RSD 分別為1.82%和1.81%（n=5），表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.6 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取5 份不同質(zhì)量的羅布麻茶，分別加入1 mL 的對(duì)照品，按“2.1.3”制備供試品溶液，在“1.4.3”色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算回收率。結(jié)果表明蘆丁和槲皮素的加樣平均回收率分別為99.94 %和99.48%，其RSD 分別為0.82%和0.60%（n=6）（表1）。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of recovery

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h按上述色譜條件測定峰面積，蘆丁和槲皮素的RSD 分別為1.06%和1.80%，結(jié)果表明供試品溶液中的蘆丁和槲皮素在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 樣品的測定

按“2.1.3”方法制備的四份樣品溶液，采用“2.2”色譜條件進(jìn)行分析測試，得到羅布麻茶樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

為了精確檢測蘆丁和槲皮素的含量，優(yōu)選檢測波長非常重要。將二極管陣列檢測器分別設(shè)定檢測波長為220、247、280、320、360 nm，在相同的色譜條件下進(jìn)樣分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蘆丁和槲皮素在360 nm 下色譜峰面積較大、分離效果較好，且羅布麻茶中的其它成分在此波長下干擾較小，故選擇360 nm 為最佳檢測波長。

表2 羅布麻茶中蘆丁和槲皮素的含量Table 2 Content of rutin and quecertin in Luobuma tea

3.2 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)蘆丁和槲皮素的極性大小[10]，本文選擇甲醇和水作為流動(dòng)相。為確定甲醇和水的比例，分別選擇在30∶70、40∶60 和50∶50 不同比例下對(duì)供試品溶液進(jìn)行分析。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇和水的比例為40∶60 時(shí)，供試品中蘆丁和槲皮素分離效果較好，且各峰對(duì)稱性良好，既能達(dá)到基線分離的要求，又有適宜的保留時(shí)間。由蘆丁和槲皮素的結(jié)構(gòu)（圖4）可知，兩者結(jié)構(gòu)中存在大量羥基，是酸解離基化合物，因此，為了抑制其解離以減少拖峰現(xiàn)象，在流動(dòng)相中加入0.3 %磷酸作為酸抑制劑[11]。本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相為甲醇：0.3 %磷酸水溶液=40∶60。

3.3 提取方法的選擇

圖5 為不同提取方法與蘆丁和槲皮素提取效率的關(guān)系圖。由圖5 可知，在相同時(shí)間范圍內(nèi)，超聲法對(duì)蘆丁和槲皮素的提取量均明顯高于熱回流法。這是因?yàn)槌暡ㄊ且环N具有強(qiáng)彈性的波，其振動(dòng)不僅會(huì)產(chǎn)生較大的能量，使體系溫度升高，進(jìn)而加速提取物在溶劑中的擴(kuò)散，而且還會(huì)使媒質(zhì)質(zhì)點(diǎn)產(chǎn)生較大的速度和加速度，增加溶劑與提取物的接觸面，快速穿透植物體，使植物中的有效成分快速從細(xì)胞中剝離出來進(jìn)入溶劑[12-14]，最終實(shí)現(xiàn)快速提取。

3.4 提取溶劑及濃度的影響

蘆丁和槲皮素都是多羥基黃酮類化合物，極性較強(qiáng)，易溶于強(qiáng)極性溶劑，但其結(jié)構(gòu)中具有苯環(huán)和碳碳雙鍵等而微溶于水，所以在羅布麻茶葉蘆丁和槲皮素含量的測定中，我們對(duì)不同極性的提取溶劑（如不同濃度的乙醇）進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示。

由圖6 可知，當(dāng)乙醇濃度低于60%時(shí)，隨乙醇濃度的增加，蘆丁提取量變化不明顯，槲皮素提取量明顯增加；當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，隨著乙醇濃度的增加，蘆丁的提取量明顯減小，槲皮素提取量的變化較小。這可能是因?yàn)樘J丁的結(jié)構(gòu)中有羰基和羥基且分子量大，極性相對(duì)較強(qiáng)，而槲皮素結(jié)構(gòu)中的羥基少，極性相對(duì)較弱的緣故。綜合考慮，選擇60%的乙醇作為提取溶劑。

3.5 超聲時(shí)間的影響

超聲時(shí)間的長短直接影響蘆丁和槲皮素的提取量。圖7 是不同超聲時(shí)間與蘆丁和槲皮素提取量的關(guān)系圖。

由圖7 可知，超聲時(shí)間對(duì)黃酮類化合物蘆丁和槲皮素的提取影響較大。隨著超聲時(shí)間的增加，蘆丁和槲皮素的提取量同時(shí)增加，當(dāng)超聲時(shí)間超過60 min 后蘆丁和槲皮素的提取量減小。這是因?yàn)樵?～60 min內(nèi)，溶劑蒸汽壓和溫度將隨超聲時(shí)間的增加而逐漸升高，大的蒸汽壓和適宜的溫度有利于蘆丁和槲皮素的浸出，使蘆丁和槲皮素的提取量逐漸增加。但是，提取過程是一個(gè)放熱反應(yīng)，溫度越高越不利于蘆丁和槲皮素的浸出[15]。所以當(dāng)超聲60 min 后，隨著時(shí)間的延長，蘆丁和槲皮素的浸出量逐漸變小。故本實(shí)驗(yàn)在超聲時(shí)間為60 min 時(shí)，蘆丁和槲皮素提取量最大。

3.6 料液比的影響

料液比是影響蘆丁和槲皮素提取量的一個(gè)重要因素。圖8 為蘆丁和槲皮素的提取量與料液比的關(guān)系圖。

由圖8 可知，隨著溶劑量的增加，蘆丁和槲皮素的提取量均逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶15（g/mL）時(shí)，蘆丁和槲皮素的提取量同時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)溶劑體積繼續(xù)增加時(shí)，蘆丁和槲皮素的量反而減小。這可能是由于當(dāng)溶劑量在一定的范圍內(nèi)時(shí)，隨著溶劑量的增加，羅布麻茶吸收的超聲波能量不斷增加，黃酮類化合物蘆丁和槲皮素的浸出量逐漸增大；當(dāng)溶劑體積過大時(shí)，羅布麻茶葉吸收能量變小，蘆丁和槲皮素的溶解量也隨之減小。因此，蘆丁和槲皮素的最佳料液比是1∶15。

4 結(jié)論

本文建立了簡便、快速的高效液相色譜法，同時(shí)測定了羅布麻茶中蘆丁和槲皮素的含量，并對(duì)影響蘆丁和槲皮素提取量的提取方法、提取溫度、提取溶劑及料液比等因素進(jìn)行研究。結(jié)果表明，蘆丁在0.0342μg～0.684 μg（r=1.000 00）和槲皮素在0.024 8 μg～0.496 μg（r=0.999 90）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其加樣平均回收率分別為99.94%和99.48%，蘆丁和槲皮素的精密度實(shí)驗(yàn)RSD 分別為0.45%和0.80%（n=5），適合羅布麻茶中蘆丁和槲皮素的同時(shí)測定。采用超聲法提取蘆丁和槲皮素的效率大于熱回流。超聲法提取蘆丁和槲皮素的最佳條件為：超聲60 min，料液比1∶15，60%的乙醇為提取溶劑。本文的測定結(jié)果為羅布麻的進(jìn)一步研究與開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

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