EGFR信號通路調(diào)控人膠質(zhì)瘤U87細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制

邢細紅,曾 暉,王雄偉△,郭東生,汪 雷,萬志先,李 燾,周紅建

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院:1.神經(jīng)外科;2神經(jīng)內(nèi)科,湖北宜昌 443003;3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院,武漢 430030)

EGFR信號通路調(diào)控人膠質(zhì)瘤U87細胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制

邢細紅1#,曾 暉1,王雄偉1△,郭東生3,汪 雷1,萬志先1,李 燾1,周紅建1

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院:1.神經(jīng)外科;2神經(jīng)內(nèi)科,湖北宜昌 443003;3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院,武漢 430030)

目的探討表皮生長因子受體(EGFR)信號通路與人膠質(zhì)瘤細胞(U87細胞)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及調(diào)控分子機制?方法 表皮生長因子(EGF,100ng/mL)?EGFR抑制劑——AG1478(10μmol/L)單獨和聯(lián)合處理U87細胞,采用MTT法和Transwell小室體外侵襲實驗檢測U87細胞增殖和體外侵襲能力;明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)?MMP-9的表達水平;Western blot法檢測磷酸化EGFR(P-EGFR)?磷酸化 AKT(P-AKT)蛋白表達?結(jié)果EGF(100ng/mL)增加P-EGFR和P-AKT蛋白表達,使加藥后24h和48h的細胞生長率分別提高了19.25%?22.32%(P0.05),使12h過膜細胞數(shù)由(27±4)個上升到(126±3)個(P0.05),促進 U87細胞的 MMP-2?MMP-9蛋白表達(P0.05);AG1478(10μmol/L)可以阻斷EGF增加P-EGFR和P-AKT蛋白表達的作用(P0.05),并具有時間依賴性(P0.05),減弱 U87細胞體外侵襲能力(P0.05),抑制MMP-2?MMP-9蛋白的表達(P0.05)?結(jié)論EGFR-PI3K/AKT信號通路參與調(diào)節(jié)U87細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程,其機制可能是EGFR-PI3K/AKT信號通路活化后,導(dǎo)致MMP-2和MMP-9蛋白的表達增加,對細胞外基質(zhì)的破壞增強?

神經(jīng)膠質(zhì)瘤;受體,表皮生長因子;基質(zhì)金屬蛋白酶類;腫瘤轉(zhuǎn)移;腫瘤細胞,培養(yǎng)的

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)在很多惡性腫瘤中出現(xiàn)突變?重排和過表達,并且與一些惡性腫瘤的預(yù)后密切相關(guān),成為了惡性腫瘤治療靶點?研究發(fā)現(xiàn)EGFR在人膠質(zhì)瘤中的過表達為64%,EGFR蛋白的表達與膠質(zhì)瘤的惡性分化程度密切相關(guān)[1],而60%的多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)中有EGFR基因的過表達[2]?EGFR過表達與相應(yīng)的配體結(jié)合后,通過不同的信號通路把細胞外信息傳遞到細胞內(nèi),作用相應(yīng)的靶基因調(diào)控腫瘤細胞增殖?侵襲轉(zhuǎn)移等細胞生物學(xué)行為?膠質(zhì)瘤的預(yù)后因素復(fù)雜,已證實EGFR參與膠質(zhì)瘤細胞增殖侵襲的調(diào)控[3],但EGFR信號通路如何調(diào)控膠質(zhì)瘤病情進展仍然不清楚,闡明其具體機制是改善膠質(zhì)瘤治療和預(yù)后的關(guān)鍵?作者通過改變膠質(zhì)瘤細胞(U87細胞)EGFR信號通路狀態(tài),研究EGFR信號通路與U87細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其分子機制?

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)?Tyrphostin AG1478?ECM gel?MTT和明膠均購于Sigma公司,胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司,Transwell(裝有聚碳酸酯微孔膜,孔徑8μm)購于美國Costar公司,磷酸化EGFR(P-EGFR)和磷酸化 AKT(P-AKT)兔抗人的單克隆抗體購于Santa Cruz公司;GAPDH小鼠抗人多克隆抗體?帶HRP的抗小鼠和兔二抗?ECL顯影液購于博士德公司,RIPA裂解液購于碧云天公司,X醫(yī)用膠片購于Kodak公司?

1.2 U87細胞的來源和培養(yǎng) U87細胞系購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所,用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)進行實驗?

1.3 實驗分組 實驗分為對照組(不加任何藥物)?實驗1組(加EGF 100ng/mL)?實 驗 2 組 (加 EGF 100ng/mL 和AG1478 10μmol/L),實驗2組在AG1478作用1h后再加EGF?

1.4 MTT法檢測細胞增殖 取對數(shù)生長期的細胞以5×103個/孔接種于96孔板,待細胞培養(yǎng)24h后加藥進行實驗?每組設(shè)4個復(fù)孔,繼續(xù)培養(yǎng)24和48h,檢測前4h每孔加MTT(5g/L)20μL和DMEM 180μL,4h后棄去上清液,加DMSO 150μL,避光震蕩15min,用全自動酶標(biāo)儀測490nm處的吸光度值[OD(490)]?細胞生長率(%)=[OD(490)實驗組-OD(490)空白]/[OD(490)對照組-OD(490)空白]×100%?

1.5 Transwell體外侵襲實驗 取對數(shù)生長期U87細胞用0.25%胰蛋白酶消化,培養(yǎng)液洗滌終止消化,900r/min離心5min,再用DMEM培養(yǎng)基懸浮細胞計數(shù)待用;低溫條件下將100μL稀釋后的ECM gel加入Transwell小室上室的PET膜上表面,37℃孵育4h使膠凝固?每組設(shè)2個復(fù)孔,在Transwell小室下室加含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基600μL,Transwell小室分別加DMEM培養(yǎng)基懸浮的細胞5×104個/孔,在37℃?5%CO2孵育箱中常規(guī)培養(yǎng)12h后,取出小室,用棉簽擦掉小室的Matrigel基質(zhì)膠和沒有侵過的細胞,再用75%的乙醇固定20min,取出小室放入結(jié)晶紫中染色40min,400倍光鏡下計5個視野細胞數(shù),取均數(shù)?

1.6 明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表達 取對數(shù)生長期細胞胰酶消化后接種于6孔板,待細胞匯合度達90%,用PBS漂洗2次,用1mL PRIM 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h,取上清2 000r/min離心5min,以去除細胞沉淀,取上清分裝,凍于-80℃冰箱?配置含0.1%明膠的10%SDS-PAGE凝膠,膠凝后配置5%上層膠?BCA法測定收集的上清蛋白濃度?取等量的蛋白,計算好體積,與2×loading buffer等比混合,室溫放置10min,上樣,冰水浴,100V恒壓電泳3h,用含2.5%Triton X-100(V/V)的超純水室溫震蕩洗凝膠2次,每次45min,中間換液?將凝膠放入孵育液內(nèi)37℃孵育42h?凝膠置于含0.1%的考馬斯亮藍R-250染色液內(nèi)(甲醇∶乙酸∶超純水為4.5∶1.0∶4.5,V/V/V)震蕩染色3h?將凝膠置于脫色液(甲醇∶乙酸∶超純水為4.5∶1.0∶4.5,V/V/V)脫色,直至能辨別藍色背景下的 MMP-2(72×103)和 MMP-9(92×103)透亮條帶?用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析讀取條帶面積?寬度和灰度值?

1.7 Western blot檢測P-EGFR和P-AKT蛋白表達 RIPA裂解液裂解細胞后,行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,用含5% 脫脂奶粉的TBST封閉1h,加一抗(P-EGFR?P-AKT和GAPDH 稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)4℃過夜?TBST洗滌3次,每次10min,分別加兔抗小鼠與羊抗兔二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記)室溫孵育1h?TBST洗滌3次,每次10min,ECL顯色,X醫(yī)用膠片攝影?

1.8 圖像分析 KODA凝膠成像系統(tǒng)照相,QUANTITY ONE分析軟件(版本4.6)分析?

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件,計量資料用±s表示,各組組間比較采用方差分析,生長率比較采用χ2檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 EGF和AG1478對U87細胞P-EGFR和P-AKT蛋白表達的影響 外源性EGF(100ng/mL)作用U87細胞24h后PEGFR和P-AKT蛋白表達同時明顯增加,與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而 AG1478(10μmol/L)能完全抑制外源性EGF的作用,使P-EGFR和P-AKT蛋白表達同時下降,與實驗1組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?見圖1?2?

2.2 EGF和AG1478對U87細胞增殖的影響 EGF(100 ng/mL)作用U87細胞24h和48h后對細胞增殖具有促進作用,細胞生長率分別較對照組提高了19.25%?22.32%(P0.05),但沒有時間依賴性(P0.05);AG1478(10μmol/L)能阻止EGF的促進細胞增長作用,明顯抑制細胞生長,與實驗1組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而且有時間依賴性(P0.05)?見圖3?

圖1 Western blot電泳圖片

圖2 EGF和AG1478對U87細胞P-EGFR和P-AKT蛋白表達的影響

圖3 EGF和AG1478對U87細胞增殖的影響

2.3 EGFR活性改變對U87細胞體外侵襲力的影響 細胞體外侵襲實驗結(jié)果顯示,體外侵襲力以侵入Transwell小室ECM凝膠PET濾膜的細胞數(shù)來判定?對照組平均每個視野細胞數(shù)為(27±4)個,實驗1組平均每個視野細胞數(shù)為(126±3)個,實驗2組平均每個視野細胞數(shù)為(43±6)個?實驗1組與對照組相比侵襲力明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);實驗2組與實驗1組比較侵襲力明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),見插Ⅰ圖4?

2.4 EGF和AG1478對U87細胞 MMP-2和 MMP-9表達的影響 EGF(100ng/mL)作用24h后 MMP-2和 MMP-9蛋白的表達均較對照組增強(P0.05);而 AG1478(10μmol/L)可以抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達,與實驗1組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?見圖5?

圖5 明膠酶譜法凝膠圖像

3 討 論

EGFR是最早發(fā)現(xiàn)的受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK),其蛋白結(jié)構(gòu)分成胞外域?跨膜區(qū)與胞內(nèi)域3部分?EGFR 家族蛋白主要有 EGFR/ErbB-1?HER2/ErbB-2?HER3/ErbB-3和 HER4/ErbB-4 4類,分別由原癌基因c-erbB(1～4)編碼,并通過可變剪切形成許多特殊受體蛋白產(chǎn)物[4]?EGFR的擴增?過表達和突變在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用,是惡性膠質(zhì)瘤的責(zé)任基因之一?董倫等[1]研究發(fā)現(xiàn)EGFR在人膠質(zhì)瘤中的過表達為64%,EGFR蛋白的表達與膠質(zhì)瘤的惡性分化程度密切相關(guān),而40%～60%GBM中有EGFR基因的過表達[5]?過度激活的EGFR可以通過Ras-MAP激酶途徑?PI3K/Akt途徑及STAT-3等3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑把細胞外信號傳到細胞內(nèi),并激活多種基因的異常表達而導(dǎo)致細胞增殖,抑制細胞凋亡,促進細胞遷移?侵襲和促進血管生成等改變?

研究發(fā)現(xiàn)EGF通過激活EGFR-PI3K/AKT信號通路促進前列腺癌細胞生長與增殖,同時提高侵襲能力,封閉EGFR基因后,EGF作用被抑制[6]?國內(nèi)有學(xué)者報道EGF激活結(jié)腸癌細胞的EGFR信號通路活化,促進 MMP-2和 MMP-9的過表達而增強結(jié)腸癌細胞的侵襲能力,這種作用可以被EGFR抑制劑 阻 斷[7-8]? 席 桂 發(fā) 等[3]研 究 卻 發(fā) 現(xiàn) 低 濃 度 EGF(100 ng/mL)可以促進膠質(zhì)瘤GL-15細胞增殖和侵襲能力增強,高濃度EGF(200ng/mL)的作用則相反,與EGF在頭頸鱗癌細胞的作用一致[9]?但目前關(guān)于EGFR信號通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移分子機制的報道很少?

本研究發(fā)現(xiàn)EGF(100ng/mL)可以促進人膠質(zhì)瘤U87細胞增殖,但是細胞生長率在24h和48h之間沒有時間依賴性,這種促進細胞增殖的作用可以被EGFR抑制劑——AG1478阻斷?同時研究發(fā)現(xiàn)EGF可以活化EGFR及下游信號通路,導(dǎo)致P-EGFR和P-AKT的表達上升,與眾多研究結(jié)果一致[7-8]?由此推測,EGFR-PI3K/AKT信號通路參與 U87細胞生長和增殖的調(diào)控?

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征之一?細胞外基質(zhì)(ECM)是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的天然屏障,ECM的破壞是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的前提?基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一組可降解ECM分子的鋅依賴性酶,可降解基底膜的ECM成分[9],在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到非常重要的作用,其中MMP-2和 MMP-9最為重要?國內(nèi)學(xué)者報道EGF促進結(jié)腸癌細胞對ECM黏附和體外侵襲力的同時,伴有MMP-2/組織型金屬蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)和 MMP-9/組織型金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)mRNA比值的升高;而阻斷EGFR后具有抑制細胞異質(zhì)黏附力和體外侵襲力作用,同時MMP-2/TIMP-2 和 MMP-9/TIMP-1mRNA 比 值 減 少[7-8]?Ellerbroek等[10]報道EGF誘導(dǎo)的卵巢癌細胞 MMP-9蛋白表達涉及EGFR下游PI3K和MAPK信號通路?本研究中Transwell小室體外侵襲實驗表明EGF提高U87細胞的侵襲能力,同時研究也 發(fā) 現(xiàn) EGF促進 MMP-2和 MMP-9的 表 達,AG1478可以降低MMP-2和 MMP-9的表達,減弱U87細胞的侵襲能力?

總之,本研究結(jié)果表明,EGFR-PI3K/AKT信號通路參與調(diào)節(jié)U87細胞生長?增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程,其機制可能是EGFR-PI3K/AKT信號通路活化后,導(dǎo)致 MMP-2和 MMP-9蛋白的表達增加,對ECM的破壞增強?

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Molecular mechanism of EGFR sinalinathwamediatininvasion and metastasis of U87 lioma cell line

gg py g g ,, ,,,,,
(1.;2.,,,, 443003,;3.,,,, 430030,)

ObjectiveTo study the relationship between EGFR signal pathway and invasion and metastasis of U87glioma cells,and discuss the molecular mechanism.MethodsU87glioma cells were cultured in medium that contained epidermal growth factor(EGF 100ng/mL)or epidermal growth factor inhibitor——AG1478(10μmol/L)or combination,then the methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)assay and transwell chamber were used to detect the proliferation and invasive ability of U87glioma cells;Expression levels of matrix metalloproteinases-2(MMP-2),matrix metalloproteinases-9(MMP-9)were determined by gelatinase zymography electrophoresis;Western blot was used to determine the expression levels of phosphorylation of the epidermal growth factor receptor(P-EGFR),and phosphorylation of protein kinase B(P-AKT).ResultsExogenous EGF(100ng/mL)increased the expression levels of P-EGFR?P-AKT,the growth ratio increased 19.25%,22.32%(P0.05)at 24,48hrespectively after treated,increased the number of invasion cell from (27±4)cells to(126±3)cells(P0.05),and increased the expression levels of MMP-2,MMP-9;AG1478could block the effects of EGF increased the expressions of P-EGFR,P-AKT in time-independent(P0.05),decreased the invasive ability of U87glioma(P0.05),inhibited the expression of MMP-2,MMP-9(P0.05).ConclusionThe EGFR-PI3K/AKT signaling pathways involved in the regulation of U87glioma cells proliferation and invasion and metastasis.Its mechanism is possible that after the EGFR-PI3K/AKT signaling pathways activated,caused the high expression of MMP-2,MMP-9and increased the damage to the exracellular matrix(ECM).

glioma;receptor,epidermal growth factor;matrix metalloproteinases;neoplasm metastasis;tumor cells,cultured

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.011

A

1671-8348(2012)18-1818-03

#現(xiàn)工作于荊州市第二人民醫(yī)院?△

,宜昌市夷陵大道183號宜昌市中心人民醫(yī)院神經(jīng)外科?

2011-11-29

2012-02-21)

?論 著?