氣相色譜法（GC）測(cè)定瓜蔞子中3,29-二苯甲?；闃侨嗜嫉暮?/h1>
2012-01-26 07:17:26楊曉穎
當(dāng)代醫(yī)學(xué) 2012年24期
楊曉穎
氣相色譜法（GC）測(cè)定瓜蔞子中3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的含量
楊曉穎
目的 建立氣相色譜法測(cè)定瓜蔞子中3,29-二苯甲?；闃侨嗜己康姆椒?。方法 Agilent DB-1701毛細(xì)管柱（30mm×0.32mm(內(nèi)徑)×0.25μm），流量2.0mL/min；進(jìn)樣口溫度280℃；檢測(cè)器溫度320℃；升溫程序?yàn)?0℃保持1.5min，以20℃/min-1升溫至230℃保持2min，10℃/min升溫至280℃保持8min。結(jié)果 在0.009625～0.09625mg/mL范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好線性關(guān)系（r＝0.9998），平均回收率為99.97%，RSD為1.09%。結(jié)論 本法簡(jiǎn)便可行、重復(fù)性好、靈敏度高，適用于瓜蔞子的質(zhì)量控制。
瓜蔞子；氣相色譜法；3,29-二苯甲?；闃侨嗜?/p>
瓜蔞子為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物瓜萎和雙邊瓜蔞的干燥成熟種子，具有潤(rùn)肺化痰、滑腸通便之功效[1]。先期的研究表明，瓜蔞子種子含有括樓仁二醇、3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇、異括樓仁二醇等多種五環(huán)三萜化合物[2]，并有部分學(xué)者應(yīng)用HPLC法對(duì)3,29-二苯甲酞基括樓仁三醇進(jìn)行了測(cè)定[3]。本文著重研究氣相色譜測(cè)定3,29-二苯甲酞基括樓仁三醇的含量，為瓜蔞子質(zhì)量評(píng)價(jià)和品質(zhì)控制提供可量化的新的技術(shù)參數(shù)。
1 資料與方法
1.1 儀器與試藥 Agilent 6890N氣相色譜儀，Agilent G1888A頂空自動(dòng)進(jìn)樣器 (Agilent公司，美國(guó))；Mettler Toledo AG135型萬分之一電子分析天平（瑞士）。
水為超純水（屈臣氏雙蒸水），其余試劑均為分析純。3,29-二苯甲酞基括樓仁三醇對(duì)照品（批號(hào)20100913，純度 99.5%）、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)膽固醇（批號(hào)20100621，純度：99.7%）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。
瓜蔞子藥材采集于信陽、焦作、駐馬店，經(jīng)專家鑒定為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物瓜萎（Trichosanthes kirilowii Maxim）干燥成熟種子。取藥材粉碎，過40目篩，制成粗粉，40℃恒溫干燥6h，得藥材樣品。
1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent DB-1701毛細(xì)管柱（30mm×0.32mm(內(nèi)徑)×0.25μm）；流量2.0mL/min；進(jìn)樣口溫度280℃；檢測(cè)器溫度320℃；升溫程序?yàn)?0℃保持1.5min,以20℃/min升溫至230℃保持2min,10℃/min升溫至280℃保持8min;載氣為氮?dú)?；進(jìn)樣量1.0μl。色譜圖見圖1。
1.3 溶液的制備
1.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱膽固醇適量，加氯仿溶解并稀釋成1mL含1.4895mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。
1.3.2 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液 精確稱取3,29-二苯甲?；闃侨嗜紝?duì)照品7.4475mg，置25mL的量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液5mL，氯仿定容，得濃度為0.2979mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
1.3.3 供試品溶液 精確稱取干燥的瓜蔞子粉末1g于索氏抽提器中，氯仿100mL，內(nèi)標(biāo)溶液1mL，熱回流提取2h，提取2次，提取液過濾后，濃縮定容至50mL，得3,29-二苯甲?；闃侨嗜继崛∥?。
2 結(jié)果
2.1 線性關(guān)系考察 精確稱取3,29-二苯甲?；闃侨嗜紝?duì)照品3.85mg，置20mL的量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1mL，氯仿溶解并定容，搖勻分別精密吸取3,29-二苯甲?；闃侨嗜紝?duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、5、7、10mL于20mL量瓶中，加氯仿稀釋至相應(yīng)的刻度，搖勻，得到不同濃度系列溶液。按照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以3,29-二苯甲?；闃侨嗜紳舛龋╔）為橫坐標(biāo)，3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇峰面積與膽固醇峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=2987.36X－239（r=0.9998）。結(jié)果表明，3,29-二苯甲?；闃侨嗜荚?.009625～0.09625mg/mL范圍內(nèi)同其與相應(yīng)膽固醇峰面積的比值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。
2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品粉末約1.0g，精密秤定。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、5、10、15、24h精密吸取供試品溶液1μl進(jìn)樣，計(jì)算3,29-二苯甲?；闃侨嗜挤迮c膽固醇峰面積的比值，結(jié)果RSD為1.12%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。
2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于5mL量瓶中，氯仿定容。精密吸取溶液1μl，重復(fù)進(jìn)樣6次,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算3,29-二苯甲?；闃侨嗜挤迮c膽固醇峰面積的比值，結(jié)果RSD為1.09 %，表明方法精密度良好。
2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品粉末6份，每份約1.0g，精密秤定。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇含量為1.487mg/g，RSD為1.19%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。
2.5 加樣回收率的測(cè)定 精密稱取已知含量樣品9份，每份約0.5g，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為0.2979mg/mL）2、2.5、3mL，分低、中、高3個(gè)濃度進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。
圖1 氣相色譜圖（A.對(duì)照品；B.樣品；1-內(nèi)標(biāo)，2-3,29-二苯甲?；闃侨嗜迹?/p>
表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）
2.6 樣品含量的測(cè)定 精密稱取采集不同地區(qū)樣品3份，每份約1.0g，分別按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的含量。結(jié)果信陽、焦作、駐馬店樣品含量分別為1.487、1.398、4.493mg/g，平均含量為2.623mg/g，RSD為1.02%。
3 討論
3.1 提取方法的選擇 對(duì)瓜蔞子中3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇提取時(shí)，選擇了超聲波提取和索氏抽提器回流提取，結(jié)果顯示索氏抽提器回流提取得率較高，故選用索氏抽提器回流提取。
3.2 溶劑的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)方法[1-2]，比較了氯仿、乙酸乙醋、乙醚、甲醇等常用溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，當(dāng)提取液中存在乙酸乙醋和乙醚時(shí)，檢測(cè)干擾較大。這可能是由于瓜蔞子中脂肪油和萜的種類較多，彼此結(jié)構(gòu)相似，根據(jù)相似相容原理，而使得大量雜質(zhì)引入。而氯仿作為溶劑，雜質(zhì)干擾較小，通過比較最終選擇氯仿作為溶劑，分離效果和峰型明顯，無干擾。
3.3 色譜條件的選擇 本文對(duì)3,29-二苯甲?；闃侨嗜嫉纳郎爻绦蜻M(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)升溫程序在80℃，保持2min，以15℃/min的速率升至230℃，保持2min，10℃/min升溫至280℃保持8min；可達(dá)到較好的分離效果。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在這種條件下的峰型較寬且峰與峰之間的分離度較低，主要可能升溫速率慢，色譜流出時(shí)間過長(zhǎng)。通過改變色譜條件，加快升溫速率，即70℃保持1.5min，以20℃/min升溫至230℃保持2min,10℃/min升溫至280℃保持8min；進(jìn)樣口溫度：280℃，通過此程序升溫的方法，待測(cè)組分的良好分離，又能實(shí)現(xiàn)盡可能短的分析時(shí)間，使3,29-二苯甲?；闃侨嗜嫉玫捷^好的分離。
[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典·一部[S].2010:104.
[2] 唐春風(fēng).瓜萎子的化學(xué)成分和定性定量研究[D].沈陽:中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，2005.
[3] 程雪梅，吳技，俞桂新,等.RP-HPLC法測(cè)定瓜萎子中3,29-二苯甲酞基括樓仁三醇含量[J].藥物分析，2005,25(4):377-379.
10.3969/j.issn.1009-4393.2012.24.014
462600 河南省臨潁縣第二人民醫(yī)院（楊曉穎）
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1.3 溶液的制備
1.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密稱膽固醇適量，加氯仿溶解并稀釋成1mL含1.4895mg的溶液，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。
1.3.2 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液 精確稱取3,29-二苯甲?；闃侨嗜紝?duì)照品7.4475mg，置25mL的量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液5mL，氯仿定容，得濃度為0.2979mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
1.3.3 供試品溶液 精確稱取干燥的瓜蔞子粉末1g于索氏抽提器中，氯仿100mL，內(nèi)標(biāo)溶液1mL，熱回流提取2h，提取2次，提取液過濾后，濃縮定容至50mL，得3,29-二苯甲?；闃侨嗜继崛∥?。
2 結(jié)果
2.1 線性關(guān)系考察 精確稱取3,29-二苯甲?；闃侨嗜紝?duì)照品3.85mg，置20mL的量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1mL，氯仿溶解并定容，搖勻分別精密吸取3,29-二苯甲?；闃侨嗜紝?duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3、5、7、10mL于20mL量瓶中，加氯仿稀釋至相應(yīng)的刻度，搖勻，得到不同濃度系列溶液。按照2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以3,29-二苯甲?；闃侨嗜紳舛龋╔）為橫坐標(biāo)，3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇峰面積與膽固醇峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=2987.36X－239（r=0.9998）。結(jié)果表明，3,29-二苯甲?；闃侨嗜荚?.009625～0.09625mg/mL范圍內(nèi)同其與相應(yīng)膽固醇峰面積的比值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。
2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品粉末約1.0g，精密秤定。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、5、10、15、24h精密吸取供試品溶液1μl進(jìn)樣，計(jì)算3,29-二苯甲?；闃侨嗜挤迮c膽固醇峰面積的比值，結(jié)果RSD為1.12%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性較好。
2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL于5mL量瓶中，氯仿定容。精密吸取溶液1μl，重復(fù)進(jìn)樣6次,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。計(jì)算3,29-二苯甲?；闃侨嗜挤迮c膽固醇峰面積的比值，結(jié)果RSD為1.09 %，表明方法精密度良好。
2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品粉末6份，每份約1.0g，精密秤定。按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇含量為1.487mg/g，RSD為1.19%。結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。
2.5 加樣回收率的測(cè)定 精密稱取已知含量樣品9份，每份約0.5g，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為0.2979mg/mL）2、2.5、3mL，分低、中、高3個(gè)濃度進(jìn)行加樣回收試驗(yàn)，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。
圖1 氣相色譜圖（A.對(duì)照品；B.樣品；1-內(nèi)標(biāo)，2-3,29-二苯甲?；闃侨嗜迹?/p>
表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）
2.6 樣品含量的測(cè)定 精密稱取采集不同地區(qū)樣品3份，每份約1.0g，分別按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇的含量。結(jié)果信陽、焦作、駐馬店樣品含量分別為1.487、1.398、4.493mg/g，平均含量為2.623mg/g，RSD為1.02%。
3 討論
3.1 提取方法的選擇 對(duì)瓜蔞子中3,29-二苯甲酰基栝樓仁三醇提取時(shí)，選擇了超聲波提取和索氏抽提器回流提取，結(jié)果顯示索氏抽提器回流提取得率較高，故選用索氏抽提器回流提取。
3.2 溶劑的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)方法[1-2]，比較了氯仿、乙酸乙醋、乙醚、甲醇等常用溶劑的提取效果。結(jié)果顯示，當(dāng)提取液中存在乙酸乙醋和乙醚時(shí)，檢測(cè)干擾較大。這可能是由于瓜蔞子中脂肪油和萜的種類較多，彼此結(jié)構(gòu)相似，根據(jù)相似相容原理，而使得大量雜質(zhì)引入。而氯仿作為溶劑，雜質(zhì)干擾較小，通過比較最終選擇氯仿作為溶劑，分離效果和峰型明顯，無干擾。
3.3 色譜條件的選擇 本文對(duì)3,29-二苯甲?；闃侨嗜嫉纳郎爻绦蜻M(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)升溫程序在80℃，保持2min，以15℃/min的速率升至230℃，保持2min，10℃/min升溫至280℃保持8min；可達(dá)到較好的分離效果。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在這種條件下的峰型較寬且峰與峰之間的分離度較低，主要可能升溫速率慢，色譜流出時(shí)間過長(zhǎng)。通過改變色譜條件，加快升溫速率，即70℃保持1.5min，以20℃/min升溫至230℃保持2min,10℃/min升溫至280℃保持8min；進(jìn)樣口溫度：280℃，通過此程序升溫的方法，待測(cè)組分的良好分離，又能實(shí)現(xiàn)盡可能短的分析時(shí)間，使3,29-二苯甲?；闃侨嗜嫉玫捷^好的分離。
[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典·一部[S].2010:104.
[2] 唐春風(fēng).瓜萎子的化學(xué)成分和定性定量研究[D].沈陽:中國(guó)醫(yī)科大學(xué)，2005.
[3] 程雪梅，吳技，俞桂新,等.RP-HPLC法測(cè)定瓜萎子中3,29-二苯甲酞基括樓仁三醇含量[J].藥物分析，2005,25(4):377-379.
10.3969/j.issn.1009-4393.2012.24.014
462600 河南省臨潁縣第二人民醫(yī)院（楊曉穎）
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