維藥毛菊苣降糖有效部位的純化工藝

張堯，信學(xué)雷，阿吉艾克拜爾·艾薩*

(1.中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所新疆特有藥用資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，新疆烏魯木齊830011;2.中國(guó)科學(xué)院研究生院，北京100049)

毛菊苣Cichorium glandulosumBoiss.et Huet屬于菊科菊苣屬，主要分布于我國(guó)新疆，為維吾爾族民間保肝利膽、利尿用藥，該植物已被《中華人民共和國(guó)藥典》、《中國(guó)民族藥志》及《新疆中草藥》收錄［1，2］。毛菊苣氣微、味咸、微苦，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫功效;用于濕熱黃疸、胃痛食少、水腫尿少［3］。目前，已知毛菊苣主要含三萜、倍半萜內(nèi)酯、香豆素、黃酮、糖類(lèi)、有機(jī)酸等多種成分［4-6］?，F(xiàn)代藥理表明，菊苣具有降血糖作用［7］，但有關(guān)降糖有效部位的工藝研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在優(yōu)化毛菊苣降糖有效部位的純化工藝，通過(guò)考查9種不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附-解吸附能力，以產(chǎn)率、蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)抑制率、ABTS抗氧化能力、醛糖還原酶(AR)抑制率為指標(biāo)，篩選最優(yōu)樹(shù)脂，并對(duì)其純化條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳純化工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:Buchi R—210型(瑞士產(chǎn));真空干燥箱:DZF—6050B型(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司);全溫震蕩培養(yǎng)箱:HZQ—F160型(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);M—5酶標(biāo)儀(美國(guó)分子儀器公司)。

HPD100，HPD300，HPD450，HPD600，HPD750，ADS-17型大孔吸附樹(shù)脂(滄州寶恩化工有限公司);X-5，D4020，D140，型大孔樹(shù)脂(南開(kāi)大學(xué)化工廠);毛菊苣購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)吉姆薩爾縣，由中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所張立運(yùn)研究員鑒定為Cichorium glandulosumBoiss.et Huet;ABST由美國(guó)Amresco公司提供，對(duì)硝基苯磷酸二鈉鹽(PNPP)由美國(guó)Sigma公司提供，還原型輔酶Ⅱ鈉鹽試劑(NADPH)購(gòu)自Roche公司，DL-甘油醛和二甲基亞砜(DMSO)均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?，水為純化水?/p>

2 方法與結(jié)果

2.1 毛菊苣提取液的制備取毛菊苣莖1.8 kg，根據(jù)文獻(xiàn)［8］所述的方法提取藥材，過(guò)濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮藥液相對(duì)密度至1.04。

2.2 樹(shù)脂的篩選根據(jù)文獻(xiàn)［9-10］的方法，將9種大孔樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h，用95%乙醇洗滌樹(shù)脂，直至流出液加3倍體積水無(wú)白色沉淀。用水洗柱，直至無(wú)醇味;抽濾。稱(chēng)取9種已處理好的大孔樹(shù)脂1 g放入錐形瓶，將毛菊苣提取液稀釋成上樣液(樣品質(zhì)量濃度P0為28.735 g/mL)，加入10 mL毛菊苣上樣液。置搖床，振搖(180 r/min，25℃)2 h，放置12 h。過(guò)濾，濾出液烘干至恒定質(zhì)量，計(jì)算濃度Pe。過(guò)濾提取液處理后的大孔樹(shù)脂水洗抽干，加95%乙醇10 mL，置搖床(180 r/min，25℃)振搖2 h，放置2 h進(jìn)行靜態(tài)解吸附。解吸液過(guò)濾烘干至恒定質(zhì)量，計(jì)算濃度Pd。

V0為上樣體積，M為樹(shù)脂質(zhì)量。分別按下式計(jì)算吸附量、吸附率、解吸率:

吸附量(mg/g濕樹(shù)脂)=(P0－Pe)×V0/M

吸附率(%)=(P0－Pe)×100/P0

解吸率(%)=Pd×100/(P0－Pe)

解吸附的樣品進(jìn)行活性測(cè)定。按照文獻(xiàn)［11］的方法測(cè)定PTP1B抑制率，即在96孔板中加入PTP1B蛋白溶液1 μL(0.115 mg/mL)，測(cè)試樣品或陽(yáng)性對(duì)照樣品1 μL或DMSO 1 μL，PBS緩沖液96 μL混勻，10 min后加入PNPP 2 μL，使其終濃度為2 mmol/L。30℃孵育30 min后，用3 mol/L NaOH終止反應(yīng)，在405 nm測(cè)定吸收值，以不含酶溶液的系統(tǒng)為空白。

抑制率=(OD405空白－OD405樣品)/OD405空白×100%。

按照文獻(xiàn)［12-13］的方法測(cè)定ABTS試劑盒抗氧化活性，即將5 mL的7 mmoL/L的過(guò)硫酸鉀混合，在室溫，避光的條件下靜置過(guò)夜，形成ABTS自由基貯備液，使用前用無(wú)水乙醇稀釋成工作液，要求其在30℃，734 nm波長(zhǎng)下的吸光度值為0.7+0.02。測(cè)定時(shí)取不同濃度的樣品液16 μL，加入184 μL的ABTS溶液，準(zhǔn)確振30 s，在20℃下測(cè)定反應(yīng)液在734 nm處6 min內(nèi)的吸光值。實(shí)驗(yàn)以VC為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)試劑空白，樣品空白和樣品實(shí)驗(yàn)組。

抑制率=［1－(At－B)/A0］×100%

其中，A0為未加樣品的吸光值;At為樣品與ABTS反應(yīng)后的吸光值;B為樣品空白的吸光值。

將文獻(xiàn)［14］的方法進(jìn)行改進(jìn)測(cè)定醛糖還原酶(AR)抑制率，即反應(yīng)體系200 μL，包括0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7)148 μL，2 mmol/L的NADPH 20 μL，10 mmol/L的DL-甘油醛20 μL，酶液10 μL，以及不同樹(shù)脂過(guò)下來(lái)的毛菊苣純化液。充分混勻后室溫放置10 min，用酶標(biāo)儀檢測(cè)340 nm處吸光值。樣品對(duì)AR的抑制率計(jì)算如下:

抑制率(%)=［1－(A2－A0)/(A1－A0)］×100%

式中，A0表示未加酶、底物和樣品，即每分鐘NADPH自然氧化吸光值的下降;A1表示未加樣品每分鐘NADPH吸光值的下降;A2為加樣品后每分鐘NADPH吸光值的下降。

計(jì)算各指標(biāo)IC50，并結(jié)合吸附率、解吸率進(jìn)行綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 9種大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附-解吸附情況Tab.1 Adsorption and desorption performance of nine kinds of macroporous resin

由表1可以看出，HPD450、HPD750、X-5、ADS-17、D4020型號(hào)樹(shù)脂對(duì)毛菊苣提取液有較強(qiáng)的吸附效果，HPD600和D4020解吸效果比較好，HPD100、HPD300、HPD600、ADS-17等吸附產(chǎn)物各項(xiàng)活性較好。由于純化的目的是得到活性較高的有效部位，因此加入了活性因素綜合評(píng)分后(吸附率、解吸率、PTP1B抑制率、ABTS抗氧化性、醛糖還原酶抑制率各占20%)，HPD100得分最高，所以選擇HPD100大孔吸附樹(shù)脂來(lái)純化毛菊苣降糖有效部位。

2.3 純化條件的研究根據(jù)文獻(xiàn)［15-16］的方法分別對(duì)上樣濃度、吸附速率、上樣量、洗脫劑濃度和洗脫劑用量進(jìn)行考察。

2.3.1 藥液質(zhì)量濃度的考察取毛菊苣提取液(質(zhì)量濃度為100 mg/mL)及由其配制成的質(zhì)量濃度為75、50、25 mg/mL的溶液各15 mL，分別加入HPD100大孔吸附樹(shù)脂柱上，以2 BV/h的速度進(jìn)行吸附后，收集流出液，計(jì)算吸附量。結(jié)果如圖1。

圖1 上樣液濃度的影響Fig.1 Effect of sam p le concentration on adsorption

由圖1可以看出，隨著藥液濃度的稀釋?zhuān)搅肯仍龊鬁p，當(dāng)藥液質(zhì)量濃度為75 mg/mL時(shí)，吸附量達(dá)到最大，當(dāng)大于此質(zhì)量濃度時(shí)，吸附量呈下降趨勢(shì)。因此選擇上樣液質(zhì)量濃度為75 mg/mL(密度相當(dāng)于1.04 g/mL)。

2.3.2 吸附速率的考察取毛菊苣提取液(75 mg/mL)30 mL，吸附在15 mL樹(shù)脂柱上，分別以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h的流速進(jìn)行吸附后，收集流出液，計(jì)算吸附量。結(jié)果如圖2。

由圖2可以看出，當(dāng)吸附速率增加時(shí)，吸附量先增后減。當(dāng)吸附速率達(dá)到3 BV/h時(shí)，吸附量達(dá)到最大。因此選擇吸附速率為3 BV/h。

2.3.3 上樣量的考察取毛菊苣提取液(75 mg/mL)200 mL，上15 mL樹(shù)脂柱，以3 BV/h的速度進(jìn)行吸附后，收集流出液，測(cè)定吸附量。樣品穿透曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。

圖2 吸附速率的影響Fig.2 Effect of flow rate on adsorption

圖3 樣品穿透曲線(xiàn)Fig.3 Effect of sample volume on adsorption

從樣品穿透曲線(xiàn)來(lái)看，上樣量從6 BV開(kāi)始，穿透速度趨于平緩，達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，且流出液與上樣液濃度幾乎相等。因此上樣量為6 BV時(shí)，樹(shù)脂柱已接近吸附飽和。

2.3.4 洗脫劑濃度的考察取毛菊苣提取液(75 mg/mL)400 mL，加入15 mL樹(shù)脂柱上，以3 BV/h的流速進(jìn)行吸附，再以5 BV/h流速用水洗4 BV后，分別用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液洗脫50 mL，收集洗脫液測(cè)定PTP-1B半數(shù)抑制濃度IC50。結(jié)果如表2。

表2 不同濃度乙醇洗脫組分PTP-1B抑制IC50Tab.2 Effect of eluent concentration on elution

由表2可知，隨乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，洗脫組分對(duì)PTP-1B的抑制活性依次降低。其中20%，40%和60%乙醇洗脫部分活性較好，但純化組分量依次增加。綜合純化組分產(chǎn)量與活性，選用60%乙醇作為洗脫濃度。

2.3.5 洗脫劑用量的考察將吸附飽和的樹(shù)脂先用水洗4 BV去除殘余樣品，再用60%的乙醇以3 BV/h的流速分別洗脫1、2、3、4、5、6、7、8 BV，收集流出液測(cè)定其濃度。結(jié)果如圖4。

圖4 洗脫劑用量的影響Fig.4 Effect of eluent volume on elution

由圖4可以看出，洗脫劑用量大于5 BV時(shí)，流出液里的樣品濃度變化很小，趨于不變，說(shuō)明洗脫劑在5 BV時(shí)大孔樹(shù)脂上吸附的物質(zhì)基本被洗脫干凈。對(duì)工廠生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，為了高效又節(jié)約成本，我們選擇洗脫劑的用量為5 BV。

3 討論

大孔吸附樹(shù)脂對(duì)樣品的吸附能力取決于樹(shù)脂的理化性質(zhì)，如比表面積，孔徑，孔隙率以及由樹(shù)脂的材料決定樹(shù)脂的極性［17］。樣品與樹(shù)脂通過(guò)氫鍵，范德華引力等作用力結(jié)合到樹(shù)脂的表面或內(nèi)部，利用這些作用力強(qiáng)弱的不同而實(shí)現(xiàn)分離;或利用篩選性原理，不同分子大小的物質(zhì)在樹(shù)脂孔隙中的保留能力不同而實(shí)現(xiàn)分離［18］。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)靜態(tài)吸附法篩選幾種不同類(lèi)型的樹(shù)脂的吸附-解吸附能力，結(jié)合活性篩選結(jié)果確定非極性HPD100樹(shù)脂為最佳吸附劑，在動(dòng)態(tài)吸附法研究HPD100的純化條件中，20%，40%，60%乙醇洗脫組分的活性較好。綜上，毛菊苣中降糖有效組分可能主要為中等極性成分。本實(shí)驗(yàn)利用糖尿病相關(guān)因子的多靶點(diǎn)活性篩選作為工藝篩選指標(biāo)，其目的性強(qiáng)，方法可靠，對(duì)食品藥品純化工藝研究有一定的參考意義。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)大孔樹(shù)脂吸附和解吸附性能的考察，及各種影響吸附的條件的系統(tǒng)考察，確定了大孔樹(shù)脂純化毛菊苣提取液有效部位的最佳工藝為:HPD100型大孔樹(shù)脂(河北滄州寶恩化工有限公司)，上樣質(zhì)量濃度為75 mg/mL，吸附速率為3 BV/h，上樣量達(dá)到6 BV時(shí)產(chǎn)量最高。洗脫時(shí)先用水以5 BV/h的流速洗4 BV除雜，再用60%乙醇以3 BV/h洗脫5 BV，活性與產(chǎn)量綜合評(píng)分最優(yōu)。此方法簡(jiǎn)便易行，周期短、成本低，可以用于工業(yè)生產(chǎn)毛菊苣降糖有效部位。

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