O/W 型丹皮酚微乳處方設(shè)計及質(zhì)量評價

開偉華，桂雙英

(1.銅陵職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽銅陵244000;2.安徽中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽合肥230031;3.安徽省中藥制劑工程技術(shù)研究中心，安徽合肥230031)

丹皮酚(paeonol，Pae)是毛莨科植物牡丹根皮和蘿摩科植物徐長卿干燥根或全草的主要活性成分?，F(xiàn)研究表明，丹皮酚具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌消炎、抗過敏、增強細胞免疫等多種藥理作用［1-2］。丹皮酚和丁香油為市售丹皮酚軟膏主要藥理活性成分，具有解熱、抗炎和抑制變態(tài)反應(yīng)的作用，兩者配伍，相得益彰。然而，市售軟膏涂于皮膚表面，藥物丹皮酚和丁香油具有揮發(fā)性，易揮發(fā)損失。微乳是由水相、油相、表面活性劑及助表面活性劑按適當比例自發(fā)形成的一種低黏度、透明或半透明、各向同性、粒徑在10～100 nm之間且熱力學(xué)穩(wěn)定的體系［3-4］。它是一種新型透皮傳遞系統(tǒng)，具有其它透皮制劑不可比擬的優(yōu)點，如能夠顯著增加難溶性藥物的溶解度，并將藥物以較高濃度貯存于皮膚一定深度，具有良好的角質(zhì)層和真皮貯藥性能［5-6］。本實驗通過偽三元相圖法，以丁香油為油相研究丹皮酚微乳形成條件，并對所丹皮酚微乳的粒徑大小、體系類型及理化性質(zhì)等進行初步研究。

1 儀器與試劑

1.1 儀器79-1磁力加熱攪拌儀(江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)，DDS-11A數(shù)顯電導(dǎo)率儀(上海虹益儀器儀表有限公司)，BS110S電子天平(上海賽多利斯天平有限公司)。

1.2 材料丁香油(天津光復(fù)精細化工研究所，061012)，Tween80(上海申宇醫(yī)藥化工有限公司)，Span80(化學(xué)純，廣東汕頭市西隴化工廠)，Tween20(化學(xué)純，天津市光復(fù)精細化工研究所)，聚氧乙烯辛基苯基醚(簡稱OP)(天津市光復(fù)精細化工研究所)，聚乙二醇硬脂酸酯15(簡稱Solutol HS 15)(德國BASF公司)，甘油(分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，丙二醇(分析純，上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司)，乙醇(分析純，上海中試化工總公司)，正丁醇(n-butanol)(宜興市第二化學(xué)試劑廠出品)，異丙醇(簡稱IPA)(天津市博迪化工有限公司)，聚乙二醇400(PEG400)(分析純，天津市光復(fù)精細化工研究所)，丹皮酚原料(上海紫源制藥有限公司，純度98.9%)，丹皮酚對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，批號:0708-9704)。

2 方法與結(jié)果

2.1 表面活性劑和助表面活性劑的篩選本實驗選擇Tween80、Solutol HS 15、OP-10、Tween20、Poloxamer188 5種HLB值符合O/W微乳要求的非離子表面活性劑，分別與助表面活性劑配制成Km比(表面活性劑與助表面活性劑的質(zhì)量比)為1的混合乳化劑，滴定1%的丁香油水溶液，結(jié)合偏光顯微鏡，以澄清透明綜合判定微乳是否形成，見表1。結(jié)果:以丁香油為油相的微乳體系中，Tween20、Tween80與正丁醇，OP-10與異丙醇，Solutol HS 15與1，2丙二醇、乙醇、異丙醇均可形成微乳，但Tween20與正丁醇形成的微乳體系不穩(wěn)定，放置后變渾濁。

2.2 偽三元相圖的繪制按一定質(zhì)量比精密稱取表面活性劑和助表面活性劑混合均勻，制成混合表面活性劑。精密稱取定量的油和水按質(zhì)量比(m1∶m2)為9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9混合均勻，在20℃條件下恒溫磁力攪拌，邊攪拌邊用混合表面活性劑滴定，直至澄清透明的微乳形成，記錄混合表面活性劑的臨界加入量。按混合表面活性劑、油、水在臨界點的質(zhì)量比，繪制偽三元相圖，確定微乳區(qū)域。澄清者為微乳(microemulsion)，用M表示;乳濁狀態(tài)者為普通乳狀液(emulsion)，用E表示，用偏光顯微鏡觀察，有折射現(xiàn)象為液晶(liquid crystal)，用LC表示，不發(fā)亮者為凝膠(gelatum)，用G表示。

2.2.1 表面活性劑和助表面活性劑的確定微乳區(qū)大小、粒徑和穩(wěn)定性為微乳的主要性質(zhì)評價指標［7］。微乳區(qū)域的大小為主要評價指標，它直接影響微乳的穩(wěn)定性，形成的微乳區(qū)越大，微乳越穩(wěn)定。本實驗通過繪制偽三元相圖從表面活性劑、助表面活性劑、Km值、pH等方面考察影響微乳形成的因素。

以丁香油為油相，分別以Tween80為表面活性劑，正丁醇為助表面活性劑;Solutol HS 15為表面活性劑，1，2丙二醇、乙醇、異丙醇為助表面活性劑;OP-10為表面活性劑，異丙醇為助表面活性劑，Km=1，繪制偽三元相圖，結(jié)果見圖1。

圖1 不同表面活性劑和助表面活性劑對相圖的影響Fig.1 Effect of different surfactants and cosufactants on the phase diagram s

由偽三元相圖可知，以丁香油為油相，以O(shè)P-10為表面活性劑形成的微乳區(qū)域面積大于分別以Tween80和Solutol HS 15為表面活性劑形成的微乳區(qū)域面積，因此，本實驗采用OP-10/異丙醇為混合表面活性劑。

2.2.2 Km和pH值的確定以丁香油為油相，OP-10為表面活性劑，異丙醇為助表面活性劑，不同Km繪制偽三元相圖，結(jié)果OP-10為表面活性劑的微乳體系中，隨著Km值從3∶2到1∶4變化，微乳區(qū)先增大后減小，Km=1微乳區(qū)最大，選擇OP-10/IPA質(zhì)量比為1。

而以O(shè)P-10/異丙醇(Km=1)為混合表面活性劑，分別以PBS6.8、雙蒸水、PBS7.4為水相，繪制偽三元相圖，考察不同pH對微乳區(qū)的影響，結(jié)果OP-10/異丙醇微乳體系中，弱酸、水和弱堿對微乳區(qū)無顯著影響。

2.2.3 油水比例的確定將適量的丁香油與一定量的水攪拌混合，加入OP-10/異丙醇(Km=1)混合表面活性劑，20℃恒溫磁力攪拌器攪拌至澄清透明，利用電導(dǎo)率判斷微乳的類型［8］，當油水比例＜0.45時為O/W型微乳，確定油水比例為0.4。

3 丹皮酚微乳的處方確定

稱取適量的丹皮酚溶于丁香油中，按油水比例為0.4加入蒸餾水，20℃磁力攪拌器攪拌下加入OP-10/異丙醇(Km=1)混合表面活性劑，繼續(xù)攪拌至透明得到丹皮酚微乳。當?shù)てし?丁香油的比例＜0.4，可形成O/W型丹皮酚微乳，本實驗選丹皮酚/丁香油的比例為0.35。確定丹皮酚微乳處方:丹皮酚5%，丁香油15%，OP-10 15%，異丙醇15%，水50%。

4 丹皮酚微乳的性質(zhì)及穩(wěn)定性考察

4.1 丹皮酚微乳類型的鑒別將水溶性的伊文思藍和油溶性的蘇丹紅分別滴加到丹皮酚微乳制劑中，觀察兩種染色劑在微乳制劑中的擴散速度［9］。經(jīng)觀察，伊文思藍的擴散速度均明顯快于蘇丹紅，表明所制備的丹皮酚微乳為O/W型。

4.2 微乳性質(zhì)參數(shù)測定20℃恒溫下測定丹皮酚微乳黏度、電導(dǎo)率、折光率，結(jié)果見表1。

表1 微乳各項參數(shù)測定(n=6)Tab.1 Parameters of m icroemulsion property(n=6)

4.3 丹皮酚微乳形態(tài)與粒徑分布取含藥微乳適量，采用負染色法制備樣品:將載有Formvar支持膜的銅網(wǎng)置于蠟板上，在膜上滴加丹皮酚微乳液，自然晾干20 min。再滴加2%磷鎢酸一滴，自然晾干10 min，用濾紙吸走多余的液體，置于透射電子顯微鏡下觀察，微乳粒子呈圓球形，分布較均勻，其平均粒徑為62.3 nm(見圖2)。用動態(tài)光散射法測定微乳各處方粒徑分布圖，空白微乳與丹皮酚微乳平均粒徑分別為56.8 nm、63.4 nm，粒徑基本呈正態(tài)分布(見圖3)。

圖2 微乳電鏡圖Fig.2 M icroemulsion under transm ission electron m icroscope

圖3 微乳粒徑圖Fig.3 Particle size and distribution of m icroemulsion measured by laser analytical method

4.4 微乳穩(wěn)定性初步考察將微乳放入高速離心機中，以10 000 r/min速度離心10 min，觀察，未見沉淀、分層、渾濁等現(xiàn)象，微乳溶液均保持透明澄清［10］。對于外觀透明或是半透明、流動性很好的水-油-乳化劑分散體系，保持100倍重力加速度離心5 min，未發(fā)生相分離，初步判斷微乳穩(wěn)定［11］。

5 HPLC法丹皮酚測定

5.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性Hypersil ODS柱(大連依利特公司，5 μm，4.6 mm×150 mm);流動相為甲醇-水-乙酸(52∶48∶2);檢測波長274 nm;柱溫為室溫;體積流量1.0 mL/min;進樣量20 μL;在此色譜條件下，微乳輔料對丹皮酚的測定無干擾，理論塔板數(shù)按丹皮酚計算應(yīng)不低于5 000。見圖4。

圖4 丹皮酚HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of paeonol

5.2 標準曲線的繪制取丹皮酚對照品約16 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，使溶解，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為312.4 μg/mL對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備溶液0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件分別進樣20μL，測定峰面積，以峰面積(A)為縱坐標，以對應(yīng)的丹皮酚對照品溶液的質(zhì)量濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，求得線性回歸方程:A=6.368 9×104C+1.762 6×104，r=0.999 9，n=6。結(jié)果表明丹皮酚在3.13～49.98 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

5.3 精密度試驗分別取低、中、高濃度的對照品溶液，在一天內(nèi)連續(xù)進樣6次，考察日內(nèi)精密度，RSD分別為0.52%，0.94%，1.06%;連續(xù)6d分別進樣，考察日間精密度，RSD分別為0.88%，1.07%，1.22%。

5.4 穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗取樣品溶液分別在0，6 h，12 h，24 h，48 h，72 h進樣測定峰面積，結(jié)果RSD為0.59%，說明3 d內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定。同一批樣品溶液6份，進樣測定，計算丹皮酚微乳中的丹皮酚含有量，RSD為0.38%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

5.5 回收率試驗按處方比例配制空白微乳，精密加入低、中、高劑量的丹皮酚對照品9份，混合均勻，照含量測定項下方法測定微乳中丹皮酚的含量，計算平均回收率為99.22%，RSD為1.43%(n=9)，見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 Results of recovery experiments of the methods

5.6 樣品定量測定取丹皮酚微乳約0.12 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加甲醇50 mL，超聲30 min，稱定質(zhì)量(加甲醇補足損失質(zhì)量)，濾過，精密量取續(xù)濾液2.0 mL轉(zhuǎn)至10 mL量瓶中，加甲醇稀至刻度，按上述色譜條件進行測定，計算丹皮酚的量，結(jié)果3批樣品的含量分別相當于標示量的102.1%，101.4%，97.8%。

6 討論

6.1 表面活性劑通常以親水親油平衡值(HLB)設(shè)計微乳配方，選擇HLB值為8～18時配制O/W型乳劑。本實驗選用HLB值大于8的表面活性劑OP-10、Tween80、Tween20、Solutol HS 15，但Tween20、Poloxamer188作為表面活性劑不能形成微乳，可能是HLB值比較高，親水性比較強，乳化能力較弱［12］。

6.2 助表面活性劑的作用主要是增加界面膜的流動性，降低界面張力，調(diào)節(jié)HLB值。醇與表面活性劑形成的界面膜柔性高，易于彎曲，易形成微乳［12］。同時，羥基的引入使得親水性增加，易和表面活性劑中聚氧乙烯基上的氧形成氫鍵，增強油水間界面膜的剛性，與水易形成液晶或凝膠，不利于形成微乳［13］。PEG400、甘油、1，2-丙二醇與表面活性Tween80、OP-10均形成凝膠。

6.3 從微乳區(qū)域角度看，Km減小，微乳區(qū)先增大再減小，這是由于當助表面活性劑正好完全鑲嵌到表面活性劑中，此時，表面活性劑與助表面活性劑形成最佳的配比，微乳結(jié)構(gòu)中增溶空間最大，載油量最大。當Km增大時，有形成液晶的趨勢，增大到一定程度不能形成微乳。

6.4 HPLC法測丹皮酚含量時，以甲醇-水(55∶45)［14］為流動相，丹皮酚峰分離度差;而用甲醇-水(52∶48)為流動相，雖然丹皮酚峰與干擾組分峰達到基線分離，但柱效低，因此在流動相中加入少量乙酸調(diào)節(jié)柱效［15］，當乙酸占流動相2%時得到柱效很好的峰，乙酸占流動相3%時柱效無顯著改變，最終確定甲醇-水-乙酸(52∶48∶2)為最佳流動相，此時，微乳中丹皮酚峰與干擾組分峰達基線分離，方法專屬性強，重復(fù)性好，回收率好。

6.5 本實驗研制丹皮酚微乳，并考察其理化性質(zhì)，處方中選用丁香油為油相，抑菌活性成分為丁香酚［16］;非離子型表面活性劑為OP-10，對皮膚無任何刺激性反應(yīng)，生物相容性好，毒性低，溶血性小，具有良好的安全性［17-18］;且異丙醇為助乳化劑，亦是很好的殺菌劑［19］。這為后續(xù)進一步研制丹皮酚微乳凝膠透皮給藥系統(tǒng)奠定實驗基礎(chǔ)。

［1］呂成明，劉海燕.丹皮酚的藥理作用研究進展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報，2005，24(2):142-143.

［2］張旃，李明昌.丹皮酚的藥理作用及機制［J］.中醫(yī)藥信息，2006，23(2):21-23.

［3］陸彬主編.藥物新劑型與新技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1998.59-89.

［4］Schechter R S.Microemulsions and Related Systems［M］.New York:Marcel Dekker，1998.1-200.

［5］Chen HB，Chang X，Weng T，et al.A study of microemulsion systems for transdermal delivery of triptolide［J］.J Control Release，2004，98(3):427-436.

［6］Sintov AC，Shapiro L.New microemulsion vehicle facilitates percutaneous penetrationin vitroand cutaneous drug bioavailabilityin vivo［J］.J Control Release，2004，95(2):173-183.

［7］平其能.現(xiàn)代藥劑學(xué)［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1998.1-856

［8］莫春生，鄰實華.十六烷基三甲基溴化胺/正丁醇/正庚烷/水四組份體系的相行為及微乳結(jié)構(gòu)研究［J］.江西師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2001，25(2):144-150.

［9］HO H O，Hsiao C C，Sheu M T.Preparation of microemulsions using polyglycerol fatty acid esters as surfactant for the delivery of protein drugs［J］.J Pharm Sci，1996，85(2):138-143.

［10］梁臻，毛聲俊，尹宗寧，等.丹參酮ⅡA靜脈乳劑的制備與質(zhì)量評價［J］.中國中藥雜志，2008，33(11):1249-1251.

［11］黃清臻，邵新璽，周廣平，等.微乳緩釋氣霧殺蟲劑的研制［J］.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2000，11(4):276-278.

［12］王曉黎，蔣雪濤，李干佐，等.非離子型表面活性劑微乳的基礎(chǔ)研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報，2001，17(6):297-300.

［13］吳順芹，李三鳴，郎軼詠，等.水包油型微乳形成因素的考察［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2005，22(2):96-99.

［14］謝文健，陳燕芬，吳打紅.HPLC法測定調(diào)腸消炎片中丹皮酚的含量［J］.中藥材，2007，30(6):740-741.

［15］張佳佳，戴靜波.高效液相色譜法測定婦樂泡騰顆粒劑中丹皮酚的含量［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(8):1911-1912.

［16］樓興隆，李曉明，張鞍靈.丁香油抑菌成分研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2006，15(3):91-93.

［17］趙國璽，朱瑤.表面活性劑作用原理［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，2003:589-634.

［18］安紅麗，歐陽五慶，王俊，等.非離子型表面活性劑微乳的研制［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版.2007，35(3):65-69.

［19］葉海英，張忠義，高申.法莫替丁微乳的研制及其質(zhì)量評價［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2003，23(1):68-70.