兩種β-環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯手性識別的串聯(lián)四極桿質(zhì)譜研究

劉治岐 王鳴剛* 劉 穎 李宇航 薛 明*

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州730050;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系，北京100069)

苯環(huán)壬酯(phencynonate，PC)是中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所研制開發(fā)的抗M膽堿能受體Ⅰ類新藥，本品不但具有較好的抗暈動病和治療梅尼爾綜合征的作用，而且還有預(yù)防治療帕金森病和癲癇的作用［1-3］。苯環(huán)壬酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)為α－苯基－α－環(huán)戊基－α－羥基乙酸－9α－［N-甲基－3－氮雜雙環(huán)(3，3，1)］壬酯，其化學(xué)結(jié)構(gòu)上有一個手性碳，形成一對對映異構(gòu)體。此對映異構(gòu)體對M受體的立體選擇性作用以及在動物體內(nèi)的處置動力學(xué)與分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義［4-5］。為了進(jìn)一步對苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體的藥效學(xué)和代謝動力學(xué)提供合理的分子作用解釋，本研究組以β-環(huán)糊精和2，3，6-三甲氧基-β-環(huán)糊精為主體分子，分別與客體分子苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體混合形成非共價復(fù)合物，應(yīng)用串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法進(jìn)行苯環(huán)壬酯手性分子與環(huán)糊精主體分子之間的手性識別和分子相互作用研究。

1 材料和方法

1.1 儀器與質(zhì)譜條件

美國Waters公司生產(chǎn)的Quattro micro串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀，ESI源，鞘氣為氮氣，掃描方式為正離子掃描。毛細(xì)管電壓3.5 kV，RF透鏡電壓0.3 V，源溫度105℃，脫溶劑溫度200℃，錐孔電壓120 V，提取錐孔電壓0.3 V，脫溶劑氣大小350 L/h，錐孔氣大小50 L/h。樣品處理后直接進(jìn)樣。

1.2 試劑與樣品制備

苯環(huán)壬酯消旋體及R/S對映體(phencynonate，PC，R/S-PC;Mr為357.3)由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所提供，純度＞99%，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式詳見圖 1。β-環(huán)糊精(β-cyclodenxxtrin，β-CD，Mr為 1 134.4)、2，3，6-三甲氧基-β-環(huán)糊精(2，3，6-tri-o-methl-βcyclodextrin，TM-β-CD，Mr為1 429.54)為美國Sigma公司產(chǎn)品。甲醇為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品。乙酸銨，北京化工廠產(chǎn)品。超純水，杭州娃哈哈集團(tuán)產(chǎn)品。

配制20 μmol/L的乙酸銨緩沖液。β-環(huán)糊精和2，3，6－三甲氧基-β-環(huán)糊精分別用純凈水重結(jié)晶后備用。用乙酸銨緩沖液分別配制成10 mmol/L的β-CD和TM-β-CD儲備液。用甲醇配制成10 mmol/L苯環(huán)壬酯消旋體及單體儲備液。量取1 mL的β-環(huán)糊精，分別與苯環(huán)壬酯及R/S對映體等體積混合，制成β-CD：PC(1：1)的混合液，超聲30 min，避光靜置12 h，調(diào)節(jié)pH至4.0～4.5之間。

同樣條件配制TM-β-CD與PC的R和S單體1：1混合液。

圖1 苯環(huán)壬酯及其對映異構(gòu)體化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of phencynonate isomersA：Rac-phencynonate;B：R-phencynonate isomer;C：S-phencynonate isomer.

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)糊精與苯環(huán)壬酯的非共價鍵結(jié)合

電壓為120 V時，在苯環(huán)壬酯的濃度高于β-環(huán)糊精的條件下，β-環(huán)糊精(Mr為1 134.4)有類似冠醚的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，其易捕捉Na+，其加合物［M+Na］+峰為1 156.9［3］。苯環(huán)壬酯(相對分子量為357)的［M+H］+峰為358.3，與理論值相符合。苯環(huán)壬酯的斷裂碎片苯基環(huán)戊基羥基乙酸與N-甲基－3－氮雜雙環(huán)［3，3，1］壬－9a中間的酯氧鍵有碎片峰m/ z 156.2［M-202］+，這與文獻(xiàn)［1］報道的結(jié)果相符合，且存在［PC+(β-CD)］+m/z 1 492.7的結(jié)合峰，說明β-CD與苯環(huán)壬酯之間存在著非共價鍵的相互作用，可通過范德華力和/或氫鍵作用進(jìn)行包結(jié)，從而形成超分子體系，這是分子識別的基礎(chǔ)［6-7］，詳見圖2。

2.2 β-環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯對映體的手性識別作用

有研究［8］表明，由于環(huán)糊精具有特殊的內(nèi)疏水與外親水的空腔結(jié)構(gòu)，一般能夠?qū)Σ煌氖中苑肿赢a(chǎn)生立體選擇性識別作用。在電壓為120 V，掃描區(qū)間為m/z 1 100～1 600，分子的摩爾比為1：1的條件下，β-環(huán)糊精分別與苯環(huán)壬酯的R異構(gòu)體和S異構(gòu)體結(jié)合的質(zhì)譜圖詳見圖3，其中1 157的峰為環(huán)糊精捕捉Na+的結(jié)合峰，1 492的峰分別為R，S型PC與環(huán)糊精相互作用形成包合物的峰。

環(huán)糊精與苯環(huán)壬酯的手性識別率用R表示［8］，則：

其中，［CD+PC］表示復(fù)合物的峰強(qiáng)度;［CD］表示環(huán)糊精的峰強(qiáng)度;Rr、Rs表示環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯異構(gòu)體的非共價結(jié)合率，r和s分別表示苯環(huán)壬酯異構(gòu)體R-PC和S-PC。分別計算圖3中β-環(huán)糊精與苯環(huán)壬酯對映體的非共價鍵結(jié)合率，結(jié)果詳見表1。

表1 苯環(huán)壬酯R/S異構(gòu)體與β-CD的手性結(jié)合常數(shù)測定值Tab.1 The measured values of chiral binding constants between phencynonate R/S isomer and β-CD

由上表可知，苯環(huán)壬酯R構(gòu)型的Rr與苯環(huán)壬酯S構(gòu)型的 RS值比較接近，兩者的比值 Rchiral為1.102。Rchiral和1相差越大，說明手性識別的效果越好，若Rchiral=1，說明基本沒有手性識別效果［9］。因此，β-環(huán)糊精與苯環(huán)壬酯的對映異構(gòu)體的立體識別能力有限。

2.3 2，3，6-三甲氧基-β-環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯對映體的手性識別作用

2，3，6－三甲氧基-β-環(huán)糊精是一種改善β-環(huán)糊精溶解性和包合復(fù)合型的衍生物，其是一種對2，3，6位上的羥基全部進(jìn)行甲氧基化的環(huán)糊精，其仍具有環(huán)糊精的內(nèi)疏水與外親水的空腔結(jié)構(gòu)，與β-環(huán)糊精相比，TM-β-CD不僅具有較好的水溶性，而且在許多情況下對疏水性客體有更強(qiáng)的包結(jié)作用和手性識別能力［10］。在電壓為120 V，掃描區(qū)間為650～1950 m/z，摩爾比為1：1的條件下，TM-β-CD分別與苯環(huán)壬酯的R異構(gòu)體和S異構(gòu)體結(jié)合的質(zhì)譜圖詳見圖4。由于TM-β-CD是β-CD的衍生物，仍易捕捉Na+，形成［M +Na］+峰為1 451，且擁有［PC+(TM-β-CD)］+m/z 1 787的結(jié)合峰，分析質(zhì)譜圖說明TM-β-CD與苯環(huán)壬酯之間也明顯存在著非共價鍵結(jié)合作用，且R型苯環(huán)壬酯與TM-β-CD的結(jié)合作用要比S型更好更完全，TM-β-CD對于手性藥物苯環(huán)壬酯異構(gòu)體具有良好的手性識別能力。

圖4 R/S-苯環(huán)壬酯與TM-β環(huán)糊精結(jié)合物的質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectrum of complexes between TM-β-cyclodextrin and phencynonateA：R-phencynonate isomer conjugates;B：S-phencynonate isomer conjugates;PC：phencynonate; TM-β-CD：2，3，6-tri-o-methyl-β-cyclodextrin.

用2.2中的環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯的手性識別率公式，計算TM-β-環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯對映體的手性結(jié)合率，結(jié)果詳見表2。

由表2可知，苯環(huán)壬酯R異構(gòu)體的Rr與苯環(huán)壬酯S異構(gòu)體的RS值差別較大，兩者的比值Rchiral為3.349。因此，TM-β-環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯的S異構(gòu)體的手性識別能力很強(qiáng)。 產(chǎn)生這種變化的原因是由于兩種環(huán)糊精結(jié)構(gòu)上的差異。實際上，苯環(huán)壬酯S異構(gòu)體對M受體的立體選擇性作用強(qiáng)于R異構(gòu)體，在藥物處置上也具有明顯優(yōu)勢［3-4］，這在一定程度上解釋了苯環(huán)壬酯S異構(gòu)體優(yōu)勢作用的分子機(jī)制。

表2 苯環(huán)壬酯R/S異構(gòu)體與TM-β-CD的手性結(jié)合常數(shù)測定值Tab.2 The measured values of chiral binding constants between phencynonate R/S isomer and TM-β-CD

TM-β-環(huán)糊精缺少仲羥基間的氫鍵作用，與β-環(huán)糊精相比，TM-β-環(huán)糊精的筒形結(jié)構(gòu)寬口的一端變得更寬，導(dǎo)致構(gòu)成環(huán)糊精基本結(jié)構(gòu)的葡萄糖糖元上的2，3位置距離增大［11-12］。當(dāng)苯環(huán)壬酯異構(gòu)體進(jìn)入TM-β-環(huán)糊精內(nèi)部時，位于端口的C-O單鍵的自然旋轉(zhuǎn)受到了抑制。由于將羥基置換成甲氧基，破壞了環(huán)糊精原有的氫鍵平衡狀態(tài)，由于氫鍵對于配位結(jié)合有較大的影響［13］，可知TM-β-環(huán)糊精與苯環(huán)壬酯之間是以疏水作用結(jié)合，并且擁有較強(qiáng)的鍵合能力［14］。

3 討論

本研究用串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法分別對β-環(huán)糊精和苯環(huán)壬酯及其異構(gòu)體的結(jié)合與手性識別進(jìn)行研究，結(jié)果表明，β-環(huán)糊精和苯環(huán)壬酯有結(jié)合作用，但β-環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯不同異構(gòu)體的手性識別能力有限。2，3，6－三甲氧基-β-環(huán)糊精對苯環(huán)壬酯異構(gòu)體具有很好的立體選擇性識別能力和不同的結(jié)合力，這可能是由于這種環(huán)糊精自身特定的空間構(gòu)型及具有不同的活性基團(tuán)決定的。2，3，6－三甲氧基-β-環(huán)糊精可以作為苯環(huán)壬酯及其衍生物異構(gòu)體的有效識別劑，本研究為苯環(huán)壬酯與兩種β-環(huán)糊精的手性識別研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

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