蛋白激酶C和磷脂酰肌醇4，5二磷酸之間相互調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展

陳興娟，張熙東，張璇，杲海霞，張海林

(河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)研究室，河北石家莊050017)

蛋白激酶C和磷脂酰肌醇4，5二磷酸之間相互調(diào)節(jié)作用的研究進(jìn)展

陳興娟，張熙東，張璇，杲海霞，張海林

(河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)研究室，河北石家莊050017)

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一個(gè)多基因家族，包含多種同工酶，分布廣泛且功能復(fù)雜，在許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮重要作用。磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸(PIP2)是分布在細(xì)胞膜中的磷脂類信號(hào)分子，在細(xì)胞中的分布和含量處于動(dòng)態(tài)變化中。PIP2的水解后生成DAG和IP3。DAG可以直接激活PKC，而IP3通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度從而改變鈣依賴型PKCs的活性。同時(shí)，PKC通過激活PI4K或PIP5K可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜PIP2水平。PKCs使離子通道蛋白發(fā)生磷酸化，改變通道蛋白與PIP2的親和力，從而影響PIP2對(duì)離子通道的調(diào)節(jié)。該文對(duì)PKCs和PIP2在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中相互調(diào)節(jié)的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

蛋白激酶C;磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸(PIP2);鈣離子;磷脂酶C(PLC);信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo);調(diào)節(jié)

磷脂酰肌醇4，5二磷酸［phosphatidylinositol(4，5)bisphosphate，PI(4，5)P2，簡(jiǎn)稱IP2］屬于膜磷脂類，對(duì)許多細(xì)胞生理活動(dòng)有調(diào)節(jié)作用。最初人們認(rèn)為PIP2的作用主要是作為細(xì)胞中重要的第二信使三磷酸肌醇［insoitiol 1，4，5 trisphosphate，Ins(1，4，5)P3，簡(jiǎn)稱IP3］和甘油二酯(diaceylglycerol，DAG)的前體。近年大量研究證據(jù)表明PIP2本身也是一種重要的第二信使。PIP2自身和許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)物質(zhì)有相互作用，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大約有100多種蛋白質(zhì)與PIP2可能有相互作用。因此直接影響細(xì)胞膜PIP2水平變化的磷脂酰肌醇的代謝也成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一個(gè)多基因家族，包含多種同工酶，分布廣泛且功能復(fù)雜。PKCs通過使底物發(fā)生絲氨酸或蘇氨酸磷酸化調(diào)節(jié)底物的生物活性進(jìn)而參與不同的信號(hào)通路，其中PIP2合成過程中的重要激酶PI4K和PIP5K(PI4K使PI肌醇環(huán)四位發(fā)生磷酸化生成PIP，后者進(jìn)一步在PIP5K的催化作用下五位發(fā)生磷酸化，最終生成信號(hào)分子PIP2)都可能就是PKCs的底物。PKC通過激活PI4K或PIP5K調(diào)節(jié)PIP2細(xì)胞膜水平。同時(shí)，G蛋白偶聯(lián)受體和生長(zhǎng)因子類受體在受到細(xì)胞外信號(hào)分子的刺激后可以激活PLC，水解PIP2生成DAG和IP3。DAG可以直接激活PKC，而IP3通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度從而改變鈣依賴型PKCs的活性。此外，PKCs使對(duì)PIP2敏感的離子通道發(fā)生磷酸化，改變了通道蛋白與PIP2的親和力從而影響PIP2對(duì)離子通道的調(diào)節(jié)。PKCs和PIP2既獨(dú)立參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)又相互影響相互調(diào)節(jié)。

本文就近年P(guān)KCs對(duì)PIP2在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中相互調(diào)節(jié)的研究進(jìn)展作一綜述。

1 PIP2調(diào)節(jié)PKCs活性

細(xì)胞外信號(hào)如激素、生長(zhǎng)因子類和機(jī)械刺激等激活G蛋白偶聯(lián)受體或酪氨酸激酶受體(RTKsR)，刺激信號(hào)傳入細(xì)胞后，活化PLC水解PI(4，5)P2，生成IP3和DAG。這是我們熟知的過程，根據(jù)PKC的激活特性可知，這一過程中的三個(gè)信號(hào)分子對(duì)不同亞型PKCs的活化都有調(diào)節(jié)作用。

Lai CL實(shí)驗(yàn)室通過分子對(duì)接模擬試驗(yàn)證明傳統(tǒng)cPKCs (包括PKCα，βⅠ，βⅡ和γ)的C2結(jié)構(gòu)與PIP2存在相互作用［1］。傳統(tǒng)PKCs(cPKCs)與細(xì)胞膜的結(jié)合是鈣依賴性的，有研究結(jié)果表明cPKCs的C2結(jié)構(gòu)可以通過β3–β4的區(qū)域與細(xì)胞膜上的PIP2相互作用，這對(duì)PKCs在細(xì)胞膜的定位具有很重要的意義，更有意思的是PKC只對(duì)PIP2的親和力高而與其他多聚磷酸磷脂酰肌醇沒有作用。進(jìn)一步研究結(jié)果表明cPKCs的C2結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜PIP2的結(jié)合降低了PKC錨定在細(xì)胞上所需鈣離子的濃度［2］。細(xì)胞膜上PIP2的濃度可以影響PKCα在細(xì)胞膜上分布［3］:研究結(jié)果表明PC12細(xì)胞經(jīng)過ATP處理以后，細(xì)胞膜上PIP2的濃度升高同時(shí)使PKCα在細(xì)胞膜的分布范圍擴(kuò)大，而這一過程卻與DAG的生成沒有關(guān)系。細(xì)胞膜上PIP2水平下降，使PKC蛋白向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移減少，并且縮短了蛋白在細(xì)胞膜上的停留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PKCα的C2結(jié)構(gòu)中的多元酸富集區(qū)域是與PIP2相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，這種相互作用與神經(jīng)細(xì)胞的分化有關(guān)。

2 PKC對(duì)細(xì)胞膜PIP2水平和分布影響

PIP2在細(xì)胞膜的合成主要受Ⅰ型磷脂酰-4-磷酸-5激酶的調(diào)控(PIP5K)，PIP5K催化PIP肌醇環(huán)5位發(fā)生磷酸化生成PIP2

［6］。如前所述PIP2是細(xì)胞眾多生命活動(dòng)不可缺少的輔助因子，如網(wǎng)格蛋白依賴性的胞吐作用、非網(wǎng)格蛋白依賴的胞吐、鈣依賴的神經(jīng)遞質(zhì)和激素的分泌作用、細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白的重排、細(xì)胞遷移和整連蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞基質(zhì)黏附作用等［7-8］。影響I型PI4P5K的因素主要是小G蛋白R(shí)ho、Rac和Cdc42［9］。PIP2的前體PI(4)P主要在高爾基體膜上生成并儲(chǔ)存［7］，PI4K以PI為底物催化肌醇環(huán)四位發(fā)生磷酸化［10］，但是PI4K確切的調(diào)控機(jī)制以及生成PIP如何轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞至今還不清楚。如前所述PIP2的合成是發(fā)生在細(xì)胞膜上的，因此我們可以推測(cè)在PI4K同工酶、小GTPase和轉(zhuǎn)運(yùn)連接器或支架蛋白之間存在一種可調(diào)控的相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，以便于在高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間形成為滿足不同轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的聚集PIP的小池。而PI4K活性的影響因素近年也受到關(guān)注:在牛的精子獲能實(shí)驗(yàn)中［11］，結(jié)果表明PI4K的激活有兩種途徑即直接被PKA激活，由PI3K介導(dǎo);由PKC激活不依賴于PI3K。而本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果也表明，爪蟾卵母細(xì)胞中細(xì)胞膜的去極化增加細(xì)胞膜PIP2水平［12］，而這一現(xiàn)象可能就是PKC介導(dǎo)的PI4K活性增加促進(jìn)PIP2的合成［13］。

受體介導(dǎo)的PI4P生成增多依賴于PKC的活性。研究［18］揭示PKC抑制劑G?-6976(只對(duì)傳統(tǒng)的蛋白激酶C(cPKCs)和蛋白激酶D(PKD)有作用而對(duì)新型的蛋白激酶C (nPKCs)沒有作用)對(duì)卡巴膽堿所引起的細(xì)胞的PIP水平的升高沒有明顯作用。相反，G?-6976的結(jié)構(gòu)類似物G?-6983 (對(duì)傳統(tǒng)的和新型的蛋白激酶C都有抑制作用，但是對(duì)PKD沒有作用)卻能明顯抑制卡巴膽堿升高PIP的作用，同樣也影響了卡巴膽堿升高PIP2的作用。3 μmol·L-1的葡萄糖和1 μmol·L-1的PMA都能升高細(xì)胞PIP水平。與卡巴膽堿不同的是PMA升高PIP的作用并不依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，但是PMA的作用能夠被LY294002和G?-6983所抑制，而不被G?-6976抑制。因此作者認(rèn)為受體激活介導(dǎo)的PIP合成增多和PLC介導(dǎo)的DAG升高以及PKC的激活有關(guān)。

3 PKC影響PIP2對(duì)離子通道的調(diào)節(jié)

隨著對(duì)PIP2作用研究的深入，PIP2對(duì)離子通道的調(diào)節(jié)作用已經(jīng)得到大家公認(rèn)。PIP2通過和細(xì)胞膜上的通道蛋白相互作用，發(fā)揮影響離子通道功能的作用。PKC是絲氨酸/酸酸磷酸激酶，許多實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PKC使與PIP2有相互作用的離子通道蛋白發(fā)生磷酸化，改變通道蛋白與PIP2的親和力，從而影響PIP2對(duì)離子通道的調(diào)節(jié)作用。

在海馬神經(jīng)元中，毒蕈堿受體的激活后通過PLC/PKC通路抑制GIRK通道［14］;谷氨酸受體介導(dǎo)的電流抑制是通過PLA2/花生四烯酸通路。GqPCR引起的電流抑制的機(jī)制是由PKC和花生四烯酸介導(dǎo)的PIP2和通道的相互作用降低實(shí)現(xiàn)的［15］。研究發(fā)現(xiàn)PMA作為PKC的激動(dòng)劑［16］可以抑制M電流［17］，但是機(jī)制尚未明確，有報(bào)道稱這種抑制作用是PKC對(duì)離子通道蛋白的直接作用，也有的稱是PKC通過影響PIP2水平而對(duì)電流產(chǎn)生抑制作用。

膽固醇抑制頸上神經(jīng)節(jié)M鉀電流的作用可以被PKC的抑制劑calphostin C所阻斷，實(shí)驗(yàn)者同時(shí)也發(fā)現(xiàn)PKC的激動(dòng)劑PDBu可以產(chǎn)生類似膽固醇的抑制M電流的作用，由此我們推測(cè)膽固醇對(duì)M電流的抑制作用是通過激活PKC來實(shí)現(xiàn)的。體外激酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KCNQ2(M通道的分子組成之一)可以被PKC催化發(fā)生磷酸化。KCNQ2的突變體(缺乏PKC磷酸化位點(diǎn))表達(dá)的M電流不受膽固醇或PDBu的影響。膽固醇抑制M電流作用機(jī)制是通道蛋白被PKC磷酸化。灌流PIP2可以減弱膽固醇和PDBu對(duì)電流的抑制作用，由此可推斷PKC磷酸化通道蛋白以后，降低了通道與PIP2的作用從而表現(xiàn)為電流的抑制作用［19］。

QT間期延長(zhǎng)綜合癥可以引起尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)甚至猝死。QT延長(zhǎng)綜合癥的主要遺傳因素是構(gòu)成復(fù)極化鉀電流IKs的KCNQ1基因的突變。研究表明［20］，腎上腺素受體激活PKA和GqPCR激活PKC都對(duì)IKs具有調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步的研究［21］發(fā)現(xiàn)PKC介導(dǎo)的IKs的激活作用是通過調(diào)節(jié)通道和PIP2的親和力來實(shí)現(xiàn)的。突變通道對(duì)細(xì)胞膜PIP2水平的變化變得不敏感，但PKC激活以后可以加強(qiáng)PIP2與通道的親和力。由此可見PKC可以通過加強(qiáng)PIP2與通道的相互作用削弱突變通道對(duì)PIP2水平變化的去敏反應(yīng)。

研究者使用單通道記錄和免疫共沉淀技術(shù)研究了內(nèi)皮素-1激活新鮮分離的家兔冠狀動(dòng)脈細(xì)胞內(nèi)源性TRPC1/C5/ C6通道的機(jī)制研究。ET(A)或ET(B)受體拮抗劑BQ-123和BQ788不能阻斷內(nèi)皮素-1激活的TRPC1/C5/C6通道，但是如果同時(shí)使用這兩種拮抗劑可以阻斷內(nèi)皮素-1的作用［22］。ET(A)和ET(B)受體激活所介導(dǎo)的通道激活作用可以被PKC的抑制劑白屈菜赤堿或抗TRPC1抗體所拮抗，這表明ET受體激活所介導(dǎo)的TRPC1通道的開放是依賴PKC的。同樣ET(A)受體所介導(dǎo)的TRPC1的開放可以選擇性被PI4K/PI3K抑制劑wortmannin(50 nmol·L-1)和PI-828所阻斷。PIP3是PI3K催化PIP2磷酸化的產(chǎn)物。外源性使用diC8-PIP3同樣可以激活PKC依賴的TRPC1的開放。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ET(A)受體激活引起的PKC依賴性的TRPC1通道的開放是通過PI3K催化PIP2生成PIP3來實(shí)現(xiàn)的。相反，ET(B)受體介導(dǎo)的TRPC1通道的開放可以被PLC的抑制劑U73122所阻斷，同時(shí)DAG的類似物OAG同樣可以啟動(dòng)PKC依賴的TRPC1的開放。OAG的這種作用又可以被抗PIP2的抗體或高濃度的wortmannin(20 μmol·L-1)所阻斷。由此可知ET(B)受體介導(dǎo)的PKC依賴性的TRPC1通道的開放是通過PI-PLC介導(dǎo)DAG的生成以及PIP2依賴的。

4 結(jié)語

細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)在1969年第一次由Martin Rodbell用來描述細(xì)胞接收、加工以及最后傳遞來自細(xì)胞外的“信號(hào)”如激素、藥物或者光照。細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程錯(cuò)綜復(fù)雜，PKCs毫無疑問參與了多條信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮著重要的作用，熒光能量轉(zhuǎn)移技術(shù)用來研究PKCs的定位激活［24］，必定更有助于我們對(duì)PKCs調(diào)節(jié)作用的了解。PIP2對(duì)PKCs的影響主要是PIP2本身和PKC的相互作用;以及PIP2的代謝產(chǎn)物IP3和DAG對(duì)PKCs活性的調(diào)節(jié)。但是，對(duì)于PIP2的代謝調(diào)節(jié)仍然缺少充足的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。我們熟知PI4K和PIP5K是PIP2細(xì)胞合成必不可少的兩個(gè)酶，PKC在PIP2合成過程中所扮演的角色也在一步一步被揭示。先進(jìn)的基因技術(shù)和蛋白質(zhì)組技術(shù)將會(huì)進(jìn)一步回答我們今天遺留在PIP2信號(hào)通路領(lǐng)域的問題。

［1］Lai C L，Landgraf K E，Voth G A，et al．Membrane docking geometry and target lipid stoichiometry of membrane-bound PKCalpha C2 domain:a combined molecular dynamics and experimental study［J］．J Mol Biol，2010，402(2):301-10．

［2］Corbalan-Garcia S，Guerrero-Valero M，Marin-Vicente C，et al．The C2 domains of classical/conventional PKCs are specific PtdIns (4，5)P(2)-sensing domains［J］．Biochem Soc Trans，2007，35 (Pt5):1046-8．

［3］Marin-Vicente C，Nicolas F E，Gomez-Fernandez J C，et al．The PtdIns(4，5)P2ligand itself influences the localization of PKCalpha in the plasma membrane of intact living cells［J］．J Mol Biol，2008．377(4):1038-52．

［4］Berridge M J，Irvine R F．Inositol trisphosphate，a novel second messenger in cellular signal transduction［J］．Nature，1984，312 (5992):315-21．

［5］Stahelin R V，Wang J，Blatner N R，et al．The origin of C1A-C2 interdomain interactions in protein kinase Calpha［J］．J Biol Chem，2005，280(43):36452-63．

［6］Di Paolo G，Moskowitz H S，Gipson K，et al．Impaired PtdIns(4，5)P2synthesis in nerve terminals produces defects in synaptic vesicle trafficking［J］．Nature，2004，431(7007):415-22．

［7］De Matteis M A，Godi A．PI-loting membrane traffic［J］．Nat Cell Biol，2004，6(6):487-92．

［8］Di Paolo G，De Camilli P．Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics［J］．Nature，2006，443(7112):651-7．

［9］Santarius M，Lee C H，Anderson R A．Supervised membrane swimming:small G-protein lifeguards regulate PIPK signalling and monitor intracellular PtdIns(4，5)P2 pools［J］．Biochem J，2006，398(1):1-13．

［10］Balla A，Balla T．Phosphatidylinositol 4-kinases:old enzymes with emerging functions［J］．Trends Cell Biol，2006，16(7): 351-61．

［11］Etkovitz N，Rubinstein S，Daniel L，et al．Role of PI3-kinase and PI4-kinase in actin polymerization during bovine sperm capacitation［J］．Biol Reprod，2007，77(2):263-73．

［12］Zhang X，Chen X，Jia C，et al．Depolarization increases phosphatidylinositol(PI)4，5-bisphosphate level and KCNQ currents through PI 4-kinase mechanisms［J］．J Biol Chem，2010，285 (13):9402-9．

［13］Chen X，Zhang X，Jia C，et al．Membrane depolarization increases membrane PtdIns(4，5)P2 levels through mechanisms involving PKC betaII and PI4 kinase［J］．J Biol Chem，2011，286(46): 39760-7．

［14］Zhang L，Lee J K，John S A，et al．Mechanosensitivity of GIRK channels is mediated by protein kinase C-dependent channel-phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate interaction［J］．J Biol Chem，2004，279(8):7037-47．

［15］Sohn J W，Lim A，Lee S H，et al．Decrease in PIP(2)channel interactions is the final common mechanism involved in PKC-and arachidonic acid-mediated inhibitions of GABA(B)-activated K+ current［J］．J Physiol，2007，582(Pt3):1037-46．

［16］杜肖娜，何宏濤，王川，張海林．PKC對(duì)兩種表達(dá)系統(tǒng)中內(nèi)向整流性鉀通道調(diào)節(jié)的不同及機(jī)制研究［J］．中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(12):1615-9．

［16］Du X N，He H T，Wang C，Zhang H L．Study of the mechanism of different regulation of Kir current in two expressions systems by PKC［J］．Chin Pharmacol Bull，2008，24(12):11615-9．

［17］Nakajo K，Kubo Y．Protein kinase C shifts the voltage dependence of KCNQ/M channels expressed in Xenopus oocytes［J］．J Physiol，2005，569(Pt1):59-74．

［18］Wuttke A，Sagetorp J，Tengholm A．Distinct plasma-membrane PtdIns(4)P and PtdIns(4，5)P2dynamics in secretagogue-stimulated beta-cells［J］．J Cell Sci，2010，123(Pt9):1492-502．

［19］Lee S Y，Choi H K，Kim S T，et al．Cholesterol inhibits M-type K+channels via protein kinase C-dependent phosphorylation in sympathetic neurons［J］．J Biol Chem，2011，285(14):10939-50．

［20］Matavel A，Medei E，Lopes C M．PKA and PKC partially rescue long QT type 1 phenotype by restoring channel-PIP2interactions［J］．Channels(Austin)，2011，4(1):3-11．

［21］Matavel A，Lopes C M．PKC activation and PIP(2)depletion underlie biphasic regulation of IKs by Gq-coupled receptors［J］．J Mol Cell Cardiol，2009，46(5):704-12．

［22］Saleh S N，Albert A P，Large W A．Activation of native TRPC1/ C5/C6 channels by endothelin-1 is mediated by both PIP3and PIP2in rabbit coronary artery myocytes［J］．J Physiol，2009，587 (Pt22):5361-75．

［23］Ayada T，Taniguchi K，Okamoto F，et al．Sprouty 4 negatively regulates protein kinase C activation by inhibiting phosphatidylinositol 4，5-biphosphate hydrolysis［J］．Oncogene，2009，28 (8):1076-88．

［24］Stubbs C D，Botchway S W，Slater S J，et al．The use of time-resolved fluorescence imaging in the study of protein kinase C localisation in cells［J］．BMC Cell Biol，2005，6(1):22．

Progress in the research of mutual regulation between PKC and PI(4，5)P2

CHEN Xing-juan，ZHANG Xi-dong，ZHANG Xuan，GAO Hai-xia，ZHANG Hai-lin
(Dept of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang050017，China)

Protein kinase C(PKC)comprises a multigene family of related serine/threonine kinases that sit at the crossroads of many signal transduction pathways，playing an important role with complex functions．Phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate (PIP2)is a key signaling molecule in cell membrane;it is not only the precursor of soluble inositol phosphate(IP3)and diacylglycerol(DAG)，it can also act as a second messenger itself．Phospholipase C(PLC)hydrolyzes PIP2to generate membranebound DAG，which activates PKC，and IP3，which mobilizes intracellular calcium to regulate the activity of PKC．The activation of PKC increases the activity of PI4 kinase or PIP5 kinase to enhance the synthesis of PIP2．This review deals with the mutual regulation between PKCs and PIP2and current progress in related research．

protein kinase C;PIP2;Ca2+，PLC;signal transduction;regulation

10．3969/j．issn．1001-1978．2012．11．005

A

1001-1978(2012)11-1497-03

R-05;R329．25;R344．5;R345．57;R348．1

2012-06-03，

2012-08-25

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No 30730031)

陳興娟(1984-)，女，博士生，研究方向:分子藥理學(xué)，E-mail:xingjuanchen@yahoo．com;張海林(1960-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:分子藥理學(xué)，通訊作者，Tel:0311-86265562，E-mail:z_ hailin@hotmail．com

時(shí)間: 2012 - 10 - 29 16: 58 網(wǎng)絡(luò)出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20121029.1658.005.html