葫蘆素B抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展

張延亭，歐陽(yáng)東云，何賢輝

(暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院組織移植與免疫實(shí)驗(yàn)中心，廣東 廣州 510632)

葫蘆素B(cucurbitacin B)是從葫蘆科等植物中分離得到的一類四環(huán)三萜類化合物，是葫蘆素家族中含量最豐富的成員，具有廣泛的藥理活性?，F(xiàn)代研究表明，葫蘆素B具有保護(hù)肝、消炎和抗腫瘤等多種生物學(xué)活性［1-3］。20世紀(jì)70～80年代，國(guó)內(nèi)已研發(fā)出葫蘆素片(含葫蘆素B和葫蘆素E)用于肝炎和原發(fā)性肝癌的輔助治療［4］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)葫蘆素B的抗腫瘤作用進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)葫蘆素B具有較強(qiáng)的抑制STAT3轉(zhuǎn)錄因子活化的作用，并認(rèn)為其抗腫瘤活性與抑制STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活化有關(guān)［3，5-9］。然而，也有不少研究報(bào)道，葫蘆素B的藥理活性與抑制STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活化無(wú)關(guān)［10-12］。目前較多研究表明，葫蘆素B可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的快速破壞，這種作用與其抗腫瘤作用密切相關(guān)［12，14-17］。由此可見，葫蘆素 B抗腫瘤作用機(jī)制還存在爭(zhēng)議，待深入研究。

1 葫蘆素B的抗腫瘤作用

1.1 葫蘆素B的體外抗腫瘤作用

葫蘆素B對(duì)多種白血病和淋巴瘤細(xì)胞具有明顯抑制作用。葫蘆素 B對(duì)5種白血病細(xì)胞 CCRF-CEM，K562，MOLT-4，RPMI-8226和 SR 的 IC50值為 15.6 ～35.3 nmol·L-1，并可引起G2/M期阻滯和凋亡［17］。此外，葫蘆素B對(duì)人淋巴瘤U937細(xì)胞的 IC50值為9.2 nmol·L-1，與抗癌藥物喜樹堿相近［18］。Haritunians等［19］報(bào)道，葫蘆素B對(duì)多種白血病和淋巴瘤細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。這些研究表明，體外培養(yǎng)的血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞對(duì)于葫蘆素B的作用具有較高的敏感性。

葫蘆素B對(duì)源自實(shí)體瘤的貼壁腫瘤細(xì)胞也表現(xiàn)出廣泛的抗腫瘤活性，其敏感性與白血病細(xì)胞相似。葫蘆素B對(duì)多種人乳腺癌細(xì)胞［16，20］、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞［14］、結(jié)腸癌SW480 細(xì)胞［12］、喉鱗狀細(xì)胞癌 Hep-2 細(xì)胞［3］、肝癌 BEL-7402和HepG2細(xì)胞［7，21］、胰腺癌細(xì)胞［8-9］和皮膚鱗癌細(xì)胞［22］等體外增殖具有濃度依賴性抑制作用，其IC50值為10-8～10-7mol·L-1，敏感性與血液系統(tǒng)腫瘤相似。此外，一些含葫蘆素 B 的植物提取物也具有廣泛的抗腫瘤作用［2，13，23］。值得注意的是，在葫蘆素B的作用下，這些腫瘤細(xì)胞往往快速發(fā)生細(xì)胞形態(tài)的變化，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，并可誘發(fā)多核細(xì)胞的形成和腫瘤細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果提示，葫蘆素B作為一種潛在的細(xì)胞骨架靶向藥物，可通過(guò)破壞細(xì)胞骨架尤其是微絲的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞變形等現(xiàn)象的發(fā)生。

1.2 葫蘆素B的體內(nèi)抗腫瘤作用

Wakimoto等［16］用乳腺癌動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，ip給予葫蘆素B 6周后，腫瘤體積較對(duì)照組縮小55%，器官和組織并未見明顯損傷。Thoennissen等［9］研究表明，葫蘆素B可明顯抑制胰腺癌生長(zhǎng)(用藥組腫瘤體積較對(duì)照組減少69.2%)及限制腫瘤轉(zhuǎn)移，且小鼠未呈現(xiàn)體質(zhì)量減輕等不良反應(yīng)。Liu等［24］報(bào)道，葫蘆素B可顯著抑制喉鱗癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)。Chan等［21］研究表明，葫蘆素B亦可抑制人肝癌BEL-7402移植瘤的生長(zhǎng)。Sun等［6］報(bào)道，葫蘆素B對(duì)人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制率為53.6%。上述研究表明，可耐受劑量的葫蘆素B具有抗腫瘤作用，提示該藥物具有潛在的抗腫瘤臨床應(yīng)用價(jià)值。

2 葫蘆素B的抗腫瘤作用機(jī)制

2.1 葫蘆素B對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

腫瘤是一類細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)失調(diào)的疾病，這也使得基于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤靶向治療成為腫瘤研究領(lǐng)域的重要方向。目前，葫蘆素B抗腫瘤的相關(guān)研究多集中在STAT3轉(zhuǎn)錄因子和絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.1.1 STAT3 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

研究發(fā)現(xiàn)，多種惡性腫瘤存在STAT3通路的活化，抑制STAT3通路可能會(huì)抑制腫瘤生長(zhǎng)和引起腫瘤細(xì)胞凋亡，因此篩選STAT3的抑制劑正日益受到重視［25］。研究表明，葫蘆素B及其他葫蘆素家族成員可抑制腫瘤STAT3通路的活化［3，5-9］，如對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，葫蘆素Ⅰ(JSI-124)10 μmol·L-1作用4 h后，均可在不影響STAT3蛋白水平情況下顯著降低STAT3的磷酸化［26］，提示抑制STAT3活化可能是葫蘆素抗腫瘤作用的重要機(jī)制。然而，最近一些研究并不支持這一觀點(diǎn)。有學(xué)者報(bào)道，高濃度葫蘆素B(50 μmol·L-1)可抑制K562細(xì)胞STAT3的磷酸化，而較低濃度葫蘆素B(5 μmol·L-1)對(duì)STAT3的磷酸化水平并無(wú)影響，但仍可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)［17］。葫蘆素E的作用也表現(xiàn)出類似的現(xiàn)象［18］。此外，目前公認(rèn)的STAT3抑制劑葫蘆素Ⅰ對(duì)STAT3基因敲除的成纖維細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用相似，提示葫蘆素Ⅰ對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能與抑制STAT3的活化無(wú)關(guān)［10］。據(jù)報(bào)道，葫蘆素B也不影響人肝癌 BEL-7402細(xì)胞 STAT3的磷酸化水平［21］。Tannin-Spitz等［13］發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B/E糖苷可引起乳腺癌細(xì)胞STAT3的活化。值得關(guān)注的是，葫蘆素B對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響晚于細(xì)胞形態(tài)和其他一些信號(hào)通路的變化［17］。可見，葫蘆素B對(duì)STAT3活化的影響因細(xì)胞和藥物濃度而異，其抗腫瘤活性可能涉及其他更為上游的作用靶點(diǎn)。

2.1.2 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過(guò)程，在細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起重要作用。已往研究表明，葫蘆素B對(duì)該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響因細(xì)胞而異。如葫蘆素B對(duì)腦瘤細(xì)胞細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2磷酸化有抑制作用［14］，并在短時(shí)間內(nèi)明顯抑制K562細(xì)胞中c-Raf、絲裂原活化蛋白和ERK1/2的磷酸化，其影響早于對(duì)STAT3的抑制［17］。然而，在人肝癌BEL-7402細(xì)胞中，葫蘆素B抑制c-Raf活化而促進(jìn)ERK1/2的磷酸化，這種矛盾現(xiàn)象可能歸因于信號(hào)通路間的交聯(lián)［21］。此外，在人肺腺癌A549和喉鱗癌細(xì)胞中，葫蘆素B可引起ERK1/2的活化［3，6］。同樣，葫蘆素 B對(duì) JNK的影響也有類似現(xiàn)象。在人肺腺癌A549細(xì)胞中，葫蘆素B用藥4 h后，可抑制JNK1的磷酸化，而在腦瘤細(xì)胞中葫蘆素B卻可誘導(dǎo)JNK，c-JUN和P38 MAPK的磷酸化，并且在抑制JNK活化后可減弱細(xì)胞形態(tài)的變化程度［14］，提示JNK/c-Jun信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在葫蘆素B的抗腦瘤作用中可能發(fā)揮一定作用。因此，葫蘆素B對(duì)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響比較復(fù)雜，而且因細(xì)胞而異，其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.1.3 其他信號(hào)通路

葫蘆素B對(duì)磷酸肌醇-3激酶/磷酸酶及張力蛋白同源的基因蛋白/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響也有報(bào)道。葫蘆素B/E糖苷引起乳腺癌細(xì)胞PKB降低［13］，而在人肺腺癌A549細(xì)胞中葫蘆素B不影響PKB活化［6］。研究表明，ERK和mTOR可磷酸化S6激酶從而誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)［27］;而在人肝癌Hep3B細(xì)胞，葫蘆素B可抑制缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)，其對(duì)NF-κB的抑制作用甚至超過(guò)已知 NF-κB抑制劑雷公藤紅素［29］。這些研究表明，葫蘆素B可能影響相當(dāng)廣泛的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

2.2 葫蘆素B對(duì)細(xì)胞骨架的影響

葫蘆素可引起細(xì)胞形態(tài)的急劇改變［11，13-16，20］，提示影響細(xì)胞骨架是葫蘆素類藥物的共性。葫蘆素B可引起腦瘤細(xì)胞骨架發(fā)生快速而顯著的變化，并且對(duì)微絲的影響早于微管［13-14］。同樣，在乳腺癌細(xì)胞中，葫蘆素B可快速誘發(fā)微絲結(jié)構(gòu)改變，隨后微管也受到影響［16］。此外，Haritunians等［19］研究表明，葫蘆素B可引起白血病細(xì)胞纖維狀肌動(dòng)蛋白聚集，而微管基本未受影響。這些研究說(shuō)明，葫蘆素B可先引起微絲結(jié)構(gòu)的改變，隨后誘發(fā)微管結(jié)構(gòu)的變化，提示肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架可能是其潛在的作用靶標(biāo)。

微絲主要以球狀肌動(dòng)蛋白和纖維狀肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)平衡形式存在。有研究表明，葫蘆素可引起纖維狀肌動(dòng)蛋白的解聚，并導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白聚集［10-11，14-15，18-19，29-30］。Momma 等［31］研究報(bào)道，葫蘆素E可直接作用于微絲。Nakashima等［18］用生物素標(biāo)記的葫蘆素E進(jìn)行親和層析，發(fā)現(xiàn)葫蘆素E和葫蘆素Ⅰ均可濃度依賴性地抑制絲切蛋白的磷酸化。Escandell等［11］報(bào)道，葫蘆素B衍生物可誘導(dǎo)凝溶膠蛋白表達(dá)，其作用不依賴于P53。但是最近研究表明，葫蘆素Ⅰ與絲切蛋白和凝溶膠蛋白的化學(xué)修飾無(wú)關(guān)［30］。這些研究表明，葫蘆素類藥物可能是通過(guò)影響肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)控因子，破壞了肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)平衡，從而誘發(fā)肌動(dòng)蛋白的異常聚集。

肌動(dòng)蛋白聚合/去聚合狀態(tài)的改變與諸多細(xì)胞生理過(guò)程如胞質(zhì)分裂、凋亡、運(yùn)動(dòng)和分泌等有關(guān)，一旦藥物影響到這種平衡，對(duì)細(xì)胞的影響是廣泛而深遠(yuǎn)的。葫蘆素B引起的細(xì)胞形態(tài)和功能的改變，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂、細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞多核化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)喪失和細(xì)胞凋亡等，可能與微絲骨架的受損有關(guān)。有研究表明，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的破壞可抑制PKB的磷酸化，從而抑制存活素的表達(dá)［32］。葫蘆素B/E糖苷也可引起類似的改變［13］。葫蘆素B停藥后，細(xì)胞變形改善，增殖能力也明顯增強(qiáng)［10，14］。此外，據(jù)報(bào)道，葫蘆素作用后，細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力幾乎完全喪失［30］。與葫蘆素相似，其他抗肌動(dòng)蛋白的藥物如加斯諾利(jasplakinolide)和抗微管蛋白的藥物如長(zhǎng)春新堿也能限制腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)［33］。綜上所述，葫蘆素B可能通過(guò)破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架而發(fā)揮其抗腫瘤作用。

2.3 葫蘆素B對(duì)細(xì)胞周期的影響

周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)組成的蛋白激酶復(fù)合體推動(dòng)細(xì)胞周期進(jìn)程，如果遇到不利于細(xì)胞周期的刺激，細(xì)胞會(huì)利用各階段的細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制做出相應(yīng)調(diào)整。抑制G1期的蛋白激酶復(fù)合體在G1/S期調(diào)控中發(fā)揮重要功能，如P21Waf1/Cip1可通過(guò)引起周期蛋白E-CDK2蛋白激酶復(fù)合體的失活，導(dǎo)致G1/S期阻滯;P21也可引起G2/M期阻滯［34］;而葫蘆素B可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞P21 的表達(dá)［8，9，13］。P34CDC2蛋白激酶(CDK1)是真核細(xì)胞G2/M期的關(guān)鍵調(diào)控蛋白［32］。葫蘆素 B/E糖苷用藥1 h后P34CDC2表達(dá)下調(diào)，24 h后P34CDC2與周期蛋白B1的表達(dá)顯著減少［13］。此外，葫蘆素B能下調(diào)周期蛋白A，周期蛋白B1，周期蛋白 D1，P34CDC2和 CDC-2 的表達(dá)［3，9，21-22］。由此提示，葫蘆素B及其衍生物可能影響多種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)和功能。

需要注意的是，葫蘆素B停藥后，細(xì)胞形態(tài)逐步改善，增殖能力顯著增強(qiáng)，但是多數(shù)細(xì)胞變?yōu)榇笮投嗪思?xì)胞［9，14］，提示葫蘆素B對(duì)胞質(zhì)分裂的影響較大，而對(duì)核分裂影響較小，而且對(duì)胞質(zhì)分裂的影響不易修復(fù)。如果上述推論正確，那么多數(shù)研究中檢測(cè)到的G2/M期阻滯細(xì)胞，很可能是已進(jìn)行完核分裂而胞質(zhì)分裂無(wú)法繼續(xù)的四倍體細(xì)胞。鑒于已知影響微絲骨架的藥物都會(huì)導(dǎo)致不同程度的細(xì)胞周期阻滯，葫蘆素B引起的細(xì)胞周期阻滯很可能是微絲骨架受損的后果。

2.4 葫蘆素B誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制

葫蘆素B誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡與Bcl-2家族、存活素、胱天蛋白酶家族、線粒體膜電位、P53和P21等因素有關(guān)。在多種腫瘤細(xì)胞中，葫蘆素B及其衍生物可抑制Bcl-2和存活素的表達(dá)［3，5，8-9，13］，激活胱天蛋白酶［8-9，12-13］以及導(dǎo)致線粒體的膜電位或通透性發(fā)生變化［3，5，13，35］。同時(shí)，葫蘆素 B 還可使 P21或 P53表達(dá)上調(diào)［8-9，13］。一方面，P53 可特異性地抑制Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)Bax的表達(dá)，似乎有利于細(xì)胞凋亡;另一方面，P53誘導(dǎo)P21上調(diào)可提高細(xì)胞的存活率［36］。有研究顯示，P53和P21有利于結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞拮抗葫蘆素所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［11］，提示葫蘆素B所引起的P21表達(dá)上調(diào)可能與腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用有關(guān)。雖然多數(shù)研究顯示葫蘆素 B 可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［5，8-9，12-13，35］，但仍有一部分研究表明該藥對(duì)細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響［3，6，14，19］，甚至具有抗凋亡作用［37-39］?？梢姡湔T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制待深入研究。

2.5 葫蘆素B對(duì)活性氧的影響

很多腫瘤細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量較高，有利于腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，并且與腫瘤的耐藥性有關(guān)。有研究表明葫蘆素類藥物具有抗氧化作用［2，40］，但Yasuda等［12］發(fā)現(xiàn)葫蘆素B引起SW480細(xì)胞內(nèi)ROS升高，并以ROS依賴的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些研究表明，葫蘆素B對(duì)ROS的影響可能因細(xì)胞而異，還需深入研究。

3 展望

葫蘆素B作為葫蘆素家族的重要成員，其抗腫瘤作用日益受到重視。雖然其抗腫瘤活性可能與抑制STAT3活化有關(guān)，但越來(lái)越多的研究表明，葫蘆素B的抗腫瘤作用與其破壞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的活性關(guān)系密切。因此，深入研究其干擾肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的作用，將為葫蘆素B以肌動(dòng)蛋白骨架為靶點(diǎn)的抗腫瘤治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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