α－葡聚糖酶在畢赤酵母中的組成型表達(dá)*

梁達(dá)奉 黃曾慰 曾練強(qiáng) 蟻細(xì)苗 李雨虹 余林

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州510006;2.廣州甘蔗糖業(yè)研究所廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510316)

甘蔗如受到刀傷或壓傷、病蟲害、火燒、霜凍或在收割后放置長時(shí)間，就會(huì)受到腸膜明串珠菌等微生物的感染而形成α－葡聚糖.從蔗汁澄清到糖的精煉，α－葡聚糖的存在給制糖工藝過程帶來不良影響，主要體現(xiàn)在糖分損失、虛假旋光度的出現(xiàn)、糖液黏度增加、過濾困難、結(jié)晶不正常以及糖產(chǎn)品適用性受限制等.利用α－葡聚糖酶(EC 3.2.1.11)在制糖工藝過程分解而直接去除α－葡聚糖是目前最佳的選擇:一方面，加入α－葡聚糖酶后，可消除α－葡聚糖對制糖工藝的負(fù)面影響，糖分回收提高3% ～5%，糖產(chǎn)品質(zhì)量明顯提高，使用任何其它澄清劑和化學(xué)助劑都無法達(dá)到此效果;另一方面，由經(jīng)過認(rèn)定的微生物產(chǎn)生的 α－葡聚糖酶是安全、無毒害的環(huán)保產(chǎn)品［1－3］.

目前商品化的 α－葡聚糖酶主要是從青霉屬(Penicillium)和毛殼屬(Chaetomium)等微生物中得到.由于真菌產(chǎn)酶的同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生抗生素和其它有害代謝物，成為α－葡聚糖酶通過美國食品和藥物管理局(FDA)認(rèn)證的一個(gè)障礙.國內(nèi)外也有報(bào)道利用基因工程方法表達(dá)α－葡聚糖酶的研究，尤其是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，但報(bào)道的畢赤酵母工程菌均為甲醇誘導(dǎo)型.在甲醇誘導(dǎo)型畢赤酵母工程菌產(chǎn)外源α－葡聚糖酶的研究中，Roca等［4］通過5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得了接近3000 U/mL的酶活.近年來，Chen等［5］用5L發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得了83.9 U/mL的酶活，Kang等［3］用10L發(fā)酵罐取得了134 U/mL的酶活.甲醇誘導(dǎo)型的醇氧化酶(AOX1)啟動(dòng)子作為一種在研究和生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子［6－7］，雖然具有高表達(dá)的特性和較成熟的發(fā)酵工藝，但是仍存在以下兩個(gè)不足之處:(1)甲醇為易燃易爆物，給安全生產(chǎn)帶來隱患;(2)甲醇具有毒性，作為誘導(dǎo)物加入發(fā)酵液后可能在產(chǎn)物中殘留，增加了產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域應(yīng)用的處理和檢測成本.而pGAPZα屬于組成型酵母表達(dá)載體，以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動(dòng)子作為外源基因啟動(dòng)子，不存在誘導(dǎo)的問題，在以葡萄糖或甘油等為碳源的培養(yǎng)基上就可以表達(dá).研究表明該啟動(dòng)子的表達(dá)水平與以甲醇為誘導(dǎo)物的AOX1啟動(dòng)子的表達(dá)水平相當(dāng)，是一種有巨大應(yīng)用潛力的表達(dá)質(zhì)粒［8－10］.與 AOX1 啟動(dòng)子相比，GAP啟動(dòng)子在保持強(qiáng)啟動(dòng)子特性的同時(shí)避免了前述的兩個(gè)缺陷，發(fā)酵過程無需加入誘導(dǎo)物即可穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)蛋白，簡化了生產(chǎn)流程，節(jié)省人力物力.而關(guān)于組成型畢赤酵母工程菌產(chǎn)外源α－葡聚糖酶的研究鮮見報(bào)道.本研究采用組成型質(zhì)粒pGAPZαA作為表達(dá)載體，構(gòu)建了組成型表達(dá)α－葡聚糖酶的畢赤酵母工程菌，其在發(fā)酵過程中無需誘導(dǎo)，避免了甲醇的使用，因此提高了生產(chǎn)和使用安全性，降低了成本.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

含目的基因的載體pUC57－dex由廣州甘蔗糖業(yè)研究所保存.畢赤酵母(Pichia pastoris)菌株KM71H、質(zhì)粒pGAPZαA購自美國Invitrogen公司;限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒均購自日本Takara公司;Dextran T2000購自美國Pharmacia公司.寡核苷酸引物委托美國Invitrogen公司合成.低鹽LB培養(yǎng)基(LLB)、YPD、YPDS培養(yǎng)基以及YPDS Zeocin抗性平板均按照美國Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊配制.YPG培養(yǎng)基含酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、甘油30g/L.

主要儀器如下:MJ Mini型 PCR 儀、Pro－teanⅡ型蛋白電泳儀，美國BIO－RAD公司生產(chǎn);DY－6C型核酸電泳儀，北京六一儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);SKY－200B型全溫度培養(yǎng)振蕩器，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn);GEL LOGIC 200型凝膠成像系統(tǒng)，美國Kodak公司生產(chǎn);2510型電轉(zhuǎn)儀，德國Eppendorf公司生產(chǎn).

1.2 表達(dá)載體pGAPZαA－dex的構(gòu)建

擴(kuò)增朱黃青霉(Penicillium minioluteum HI－4)基因組中的α－葡聚糖酶基因，其后連接入pUC57中得到克隆載體pUC57－dex.根據(jù)目的基因和表達(dá)載體pGAPZαA的序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對基因擴(kuò)增引物，在上下游引物中分別引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)，相應(yīng)地得到CACTCTCC3')，其中下劃線所示為酶切位點(diǎn).以質(zhì)粒pUC57－dex為模板，PCR擴(kuò)增條件為:95℃ 5 min，94℃ 1min，50℃ 1 min，72℃ 2 min，共 32 個(gè)循環(huán);72℃10 min.用膠回收試劑盒回收擴(kuò)增片段.用EcoRI和NotI限制性內(nèi)切酶分別對回收的基因擴(kuò)增片段和質(zhì)粒pGAPZαA進(jìn)行雙酶切，條件為37℃ 12h.酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后連接過夜.連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，在含25μg/mL Zeocin的LLB平板上篩選陽性克隆.挑取陽性菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后分別進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)與EcoRI、NotI雙酶切鑒定.酶切與PCR鑒定正確的陽性質(zhì)粒送交測序，確認(rèn)序列和讀碼框，最后驗(yàn)證無誤的重組質(zhì)粒命名為 pGAPZαA－dex.

1.3 重組工程菌 KM71H/pGAPZαA－dex的構(gòu)建

表達(dá)載體pGAPZαA－dex使用AvrⅡ于37℃進(jìn)行8h酶切使之線性化.瓊脂凝膠電泳檢測重組質(zhì)粒是否酶切完全，檢測后切膠回收，純化產(chǎn)物.感受態(tài)酵母細(xì)胞的制備參照文獻(xiàn)［11］.線性化質(zhì)粒(10 μg)與感受態(tài)畢赤酵母KM71H(80 μL)混合，電擊轉(zhuǎn)化條件為:1500V、25μF、200 Ω.酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化之后涂布于 YPDS 抗性平板上(含 100 μg/mL Zeocin)，30℃培養(yǎng)3～4天后長出單菌落.采用1.2中所述的引物P1和P2，以煮－凍－煮法［12］制備的轉(zhuǎn)化子基因組作為模板進(jìn)行PCR，能夠擴(kuò)增得到1700 bp左右片段的轉(zhuǎn)化子為陽性轉(zhuǎn)化子.

1.4 產(chǎn)酶工程菌的搖瓶發(fā)酵

通過不同梯度濃度Zeocin的YPD平板從陽性轉(zhuǎn)化子中挑選出數(shù)株高拷貝克隆.將平板上的單克隆接入50 mL YPG培養(yǎng)基中作為一級培養(yǎng)，30℃、250 r/min的條件下培養(yǎng)至 D(600)=5.0時(shí)，取40mL接入360mL YPG培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng).第72小時(shí)補(bǔ)加甘油，甘油補(bǔ)加量為培養(yǎng)基總量的3%.每隔12h取樣測定濕重、D(600)、酶活.每隔24 h收集發(fā)酵液，12000r/min離心5min，收集上清.100mg三氯乙酸(TCA)加入1mL上清液，冰浴1 h.12000 r/min離心20 min，收集沉淀，溶于 100 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，之后用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS－PAGE)分析.

酶活測定方法:將重組畢赤酵母發(fā)酵液經(jīng)12000r/min離心5min的上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后即為本實(shí)驗(yàn)所用酶液.取900 μL 0.02 g/mL的葡聚糖(Dextran T2000)溶液，置于45℃恒溫水浴中至少保溫5min，然后加100μL酶液.精確反應(yīng)10min，立即加入2mL二硝基水楊酸鈉試劑(DNS)以終止反應(yīng)，沸水浴5 min，然后迅速將其冷卻，用蒸餾水定容至25mL，于540nm下測定吸光值.從標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得相對應(yīng)的葡萄糖的量，并計(jì)算出酶活.酶活定義:采用DNS法，在45℃、pH=5.5的條件下，每分鐘催化底物(0.02 g/mL Dextran T2000)水解產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位，以U表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pGAPZαA－dex的鑒定

以P1和P2作為引物通過PCR方法擴(kuò)增α－葡聚糖酶基因，10g/L瓊脂凝膠電泳(見圖1)顯示，得到單一DNA條帶，長度約為1700bp，與設(shè)計(jì)的目的片段長度相符.

圖1 PCR擴(kuò)增α－葡聚糖酶基因Fig.1 PCR amplification of dextranase gene

如圖2所示，α－葡聚糖酶基因經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，與組成型分泌表達(dá)載體pGAPZαA連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGAPZαA－dex，目標(biāo)基因之后連接有6×His標(biāo)簽的基因序列.

將連接好的表達(dá)載體進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，繼而進(jìn)行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，結(jié)果見圖3.將該陽性質(zhì)粒送交Invitrogen公司測序，結(jié)果顯示基因序列完整，無堿基突變，且重組表達(dá)載體的讀碼框正確，表達(dá)載體pGAPZαA－dex構(gòu)建成功.

圖2 重組質(zhì)粒pGAPZαA－dex的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of recombinant plasmid pGAPZαA－dex

圖3 質(zhì)粒pGAPZαA－dex的雙酶切鑒定Fig.3Characterization of pGAPZαA－dex by EcoRⅠ/NotⅠdigestion

2.2 重組工程菌的PCR鑒定

挑選若干Zeocin抗性平板上的轉(zhuǎn)化子，采用煮－凍－煮法制備各轉(zhuǎn)化子的基因組作為PCR檢測的模板，PCR結(jié)果如圖4所示.選出鑒定為陽性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn).

圖4 經(jīng)pGAPZαA－dex轉(zhuǎn)化后KM71H的PCR驗(yàn)證Fig.4 Confirmation of KM71H transformed with pGAPZαA－dex by PCR

2.3 搖瓶發(fā)酵結(jié)果

挑選2.2搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中較高產(chǎn)的菌株在YPG培養(yǎng)中基搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)120h酶活達(dá)到60.4U/mL，菌體D(600)為38.7.接種12h之后菌體生長迅速，進(jìn)入對數(shù)期.產(chǎn)酶量也隨之較快地積累.培養(yǎng)72 h之后，酵母生長減緩，酶活積累也隨之放緩.從發(fā)酵數(shù)據(jù)可知，72h時(shí)酶活達(dá)到50.4 U/mL，96 h時(shí)酶活達(dá)到58.5 U/mL，直至120 h達(dá)到頂點(diǎn)(見圖5).實(shí)際上72 h至96 h之間即可作為發(fā)酵的終點(diǎn)取得最佳的效益.筆者正在進(jìn)行的5 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn).從酶活曲線和菌體密度曲線來看，二者不僅有較強(qiáng)的趨勢一致性，而且還具有正相關(guān)性，說明發(fā)酵液中菌體密度越高，目標(biāo)產(chǎn)物的濃度越高;這是組成型表達(dá)的一個(gè)顯著特點(diǎn).

圖5 搖瓶發(fā)酵酶活和D(600)變化曲線Fig.5 Dextranase activity and D(600)profiles in shake flask cultures

分析預(yù)測 α－葡聚糖酶的相對分子質(zhì)量為65000，SDS－PAGE分析顯示發(fā)酵液上清中含有相對分子質(zhì)量接近66000的特異條帶，這說明本研究成功表達(dá)了α－葡聚糖酶(見圖6).

圖6 搖瓶發(fā)酵液上清SDS－PAGE分析Fig.6 SDS－PAGE analysis of supernatants from shake flask cultures

3 結(jié)語

本研究構(gòu)建了組成型表達(dá)載體pGAPZαA－dex，以畢赤酵母為平臺(tái)成功表達(dá)了α－葡聚糖酶，該融合蛋白相對分子質(zhì)量約為66000，搖瓶發(fā)酵120h酶活達(dá)60.4U/mL.組成型畢赤酵母工程菌的發(fā)酵避免了有毒易燃易爆品——甲醇的使用，既便于大規(guī)模生產(chǎn)，也有利于發(fā)酵產(chǎn)品通過食品藥品安全認(rèn)證，為探索適用于制糖工業(yè)的α－葡聚糖酶的開發(fā)打下了基礎(chǔ).下一步將進(jìn)行發(fā)酵罐流加培養(yǎng)工程菌的試驗(yàn)，逐級放大培養(yǎng)規(guī)模，通過優(yōu)化發(fā)酵工藝和分離純化工藝，降低α－葡聚糖酶的生產(chǎn)成本.

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