致死型約氏瘧原蟲感染BALB／c小鼠巨噬細胞的作用地位研究＊

馮 輝，潘艷艷，李 瑩，曹雅明

瘧疾是人類最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病。2010年世界瘧疾報告顯示，2009年有2～3億瘧疾臨床病例，病死人數(shù)高達100萬［1］。我國也制定了“十二·五”期間在中國境內(nèi)消滅瘧疾的宏偉計劃。因此，研制開發(fā)瘧疾疫苗和抗瘧新藥已經(jīng)成為當今世界亟待解決的重大課題，而瘧原蟲感染宿主機體應答的免疫學基礎研究是其重要前提［2］。

動物模型和人體研究的結果均已表明：固有免疫和適應性免疫共同參與抗瘧保護性免疫應答。固有免疫應答有直接抗瘧原蟲效應，在清除瘧原蟲感染紅細胞（iRBCs）中抗瘧天然免疫發(fā)揮重要防御作用［3－5］。CD4＋T細胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過程中，通過分泌以IFN－γ增加為主的Th1型細胞因子顯著遏制原蟲的爆發(fā)性增殖［6－7］。固有免疫對啟動適應性免疫應答尤其是CD4＋T細胞和抗體應答是必需的［8］。然而，固有免疫應答過強亦可導致重癥瘧疾等相關病理損傷［9］。目前，與適應性免疫應答機制研究相比，固有免疫在瘧疾急性期感染中的保護性作用尚有待深入研究與闡明。

巨噬細胞是參與固有免疫應答的主要細胞。體內(nèi)注射氯磷酸二鈉脂質體是一種有效消除體內(nèi)巨噬細胞的方法［10－11］。為此，本研究擬通過建立巨噬細胞消除的鼠瘧模型，探討吞噬細胞在致死型約氏瘧原蟲（Plasmodiumyoelii17XL，P．yoelii17XL）感染的BALB／c小鼠模型中的作用地位及可能的免疫保護作用機制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物、瘧原蟲與主要試劑 6～8w齡，雌性BALB／c小鼠，購自中國科學院上海實驗動物中心。P．yoelii17XL，日本愛媛大學分子寄生蟲學教研室惠贈。以下單克隆抗體（mAb）均購自美國BD Bioscience：抗－F4／80－FITC mAb（BM8）和FcγIII／II封閉抗體（2．4G2）。

1．2 實驗動物感染和吞噬細胞消除模型建立 在感染－2、0d腹腔注射氯磷酸二鈉脂質體（clodronate liposomes，300μL／只／次），建立巨噬細胞體內(nèi)消除模型。對照組小鼠在同時點注射同體積PBS脂質體。小鼠腹腔注射1×106P．yoelii17XL寄生的紅細胞（pRBC）。尾靜脈采血，制備薄血膜，Giemsa染色，顯微鏡檢計數(shù)原蟲血癥，動態(tài)觀察生存率。

1．3 脾細胞培養(yǎng) 小鼠感染0d、3d和5d常規(guī)無菌摘取脾臟，用10mL含5%熱滅活FCS的RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，350×g室溫離心10 min。經(jīng)0．17mol／L NH4Cl裂解紅細胞、RPMI1640洗滌2次，以臺盼藍液檢查脾細胞活性，確定活細胞超過90%。用含10%FCS的RPMI1640調整脾細胞終濃度至1×107個／mL，24孔培養(yǎng)板（FALCON），每孔加入500μL細胞懸液，一式3孔，培養(yǎng)48h。350×g室溫離心10min，收集上清，－80℃保存，待細胞因子測定。

1．4 脾細胞FACs分析 取0．1mL脾細胞懸液，預先加入FcγⅢ／Ⅱ封閉抗體1μg封閉30min。設陰性對照管，每份樣品同時用抗－F4／80－FITC進行細胞表面標記，4℃孵育30min。洗滌1次，棄上清，用0．5ml FBS／PBS重懸細胞，待流式細胞儀進行檢測。

1．5 細胞獲取與分析 利用流式細胞儀（FACSAria II，美國B＆D公司）獲取細胞，使用前向散射角（FSC）及側向散射角（SSC）確定淋巴細胞群。以陰性對照為參考，每個樣品獲取10 000～50 000個細胞。利用FAC expressV3software分析流式結果。

1．6 細胞因子檢測 雙抗體夾心ELISA法分別對小鼠脾細胞培養(yǎng)上清IFN－γ、IL－10含量進行定量檢測，酶標儀（InterMedNJ－2100）測定450nm 處 OD值。繪制標準曲線，計算細胞因子含量（pg／mL）。

1．7 NO水平檢測 Griess方法檢測NO－2濃度，酶標儀（InterMedNJ－2100）測定550nm 處 OD 值。繪制標準曲線，計算NO含量（μmol／L）。

1．8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11．5統(tǒng)計學分析軟件，Student’sttest比較分析組內(nèi)和組間均值的顯著性差異。P≤0．05為差異顯著。

2 結 果

2．1P．yoelii17XL感染BALB／c小鼠巨噬細胞消除和對照組原蟲血癥和生存率 PBS脂質體對照在感染后2d外周血出現(xiàn)感染紅細胞，原蟲血癥于感染后6d達峰值42．5%。小鼠感染后5d出現(xiàn)死亡，達峰值后小鼠全部死亡。巨噬細胞消除組原蟲血癥較對照組比較提前出現(xiàn)，于感染后4d達峰值40．8%。巨噬細胞消除組在感染后1d出現(xiàn)死亡，于原蟲血癥達峰值后，即感染后5d小鼠全部死亡。由此顯示，巨噬細胞消除后加速P．yoelii17XL感染BALB／c小鼠的感染進程且明顯影響瘧疾感染的最終結局。

2．2P．yoelii17XL感染BALB／c小鼠巨噬細胞消除和對照組脾巨噬細胞數(shù)量 為評估巨噬細胞消除效果，F(xiàn)ACS檢測兩組小鼠脾巨噬細胞數(shù)量。結果顯示，與對照組相比，在感染后0d，巨噬細胞消除組脾F4／80＋巨噬細胞占脾總細胞數(shù)的百分率和細胞絕對值均明顯降低（P＜0．01）。在感染后3～5 d，巨噬細胞消除組脾F4／80＋巨噬細胞百分率和細胞絕對數(shù)量一直保持低水平，明顯低于對照組（P＜0．01）。由此表明，巨噬細胞消除模型建立成功。

圖1 P．yoelii 17XL感染BALB／c小鼠巨噬細胞消除和對照組原蟲血癥（A）和生存率（B）Fig．1 P．yoelii 17XL infection in BALB／c mice from macrophage depleted group and control groupA：Parasitemia；B：Survival rate of mice．

2．3P．yoelii17XL感染BALB／c小鼠巨噬細胞消除和對照組脾炎癥因子水平 我們對參與調控瘧疾感染的重要前炎癥因子進行檢測。ELISA結果顯示，與對照組相比，在感染后3～5d，巨噬細胞消除組小鼠脾上清IFN－γ分泌水平明顯降低（P＜0．01），IL－10分泌水平亦明顯降低（P＜0．01）。在感染后3～5d，巨噬細胞代表性因子NO在巨噬細胞

消除組明顯降低（P＜0．01）。

圖2 P．yoelii 17XL感染BALB／c小鼠巨噬細胞消除和對照組脾巨噬細胞數(shù)量比較A：巨噬細胞占脾細胞總數(shù)的百分含量；B：巨噬細胞絕對值。＊＊：P＜0．01．Fig．2 Comparison on the number of macrophages in BALB／c infected with P．yoelii 17XL from macrophage depleted group and control groupA：Percentage of macrophages in spleen cells；B：Absolute numbers of macrophages；＊＊：P＜0．01．

圖3 P．yoelii 17XL感染BALB／c小鼠巨噬細胞消除和對照組脾臟炎癥因子水平A：IFN－γ水平；B：IL－10水平；C：NO水平；＊＊：P＜0．01．Fig．3 The levels of pro－inflammation in BALB／c infected with P．yoelii 17XL from macrophage depleted group and control groupA：IFN－γ；B：IL－10；C：NO；＊＊：P＜0．01．

3 討 論

固有免疫應答參與控制瘧疾感染。本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細胞與瘧疾感染結局密切相關。巨噬細胞消除后，以IFN－γ為代表的前炎癥應答水平明顯降低，巨噬細胞特征性因子NO水平明顯降低，抗炎癥細胞因子IL－10亦明顯降低，原蟲血癥峰值提前出現(xiàn)。由此顯示，巨噬細胞消除加速瘧疾感染進程且加重疾病嚴重性，進而證實巨噬細胞對控制紅內(nèi)期感染發(fā)揮重要免疫保護作用。

血液中的單核細胞和組織中的巨噬細胞對控制原蟲血癥發(fā)揮重要作用，清除iRBCs與單核－巨噬細胞功能活性有關［12］。研究證實，惡性瘧患者外周血循環(huán)中的單核細胞在體外具有很強的抗體依賴細胞抑制活性（ADCI）。瘧原蟲感染可以誘導單核－巨噬細胞以抗體非依賴方式直接削弱原蟲負荷，同時通過啟動和調控適應性免疫應答，以抗體依賴的調理作用和ADCI方式清除iRBCs［13］。本研究利用巨噬細胞消除模型進而感染致死型約氏瘧原蟲，結果顯示，感染后1d小鼠即出現(xiàn)死亡，且原蟲血癥增殖速度和幅度明顯高于對照組，由此進一步證實在瘧原蟲感染早期巨噬細胞具有重要的控制原蟲血癥作用。

最新研究證實，分別感染P．yoelii17XL或P．yoelii17XNL的BALB／c小鼠腹腔巨噬細胞裂解pRBC能力增強，這與巨噬細胞表面TLR2和胞內(nèi)轉錄因子 MyD88，IRAK－1和TRAF－6表達增高有關［14］。與無法抵抗P．yoelii17XL感染相比，BALB／c小鼠更能控制P．yoelii17XNL感染與巨噬細胞TLR高表達維持更長時間有關［14］。我們近期研究證實，牛膝多糖作為免疫調節(jié)劑可上調巨噬細胞數(shù)量，增強Th1型免疫應答，進而抵抗P．yoelii17XL感染［15］。本研究結果顯示，巨噬細胞消除組Th1型細胞因子IFN－γ分泌水平明顯受到影響，不能有效建立CD4＋Th1型免疫應答。由此進一步強化固有免疫應答對啟動適應性免疫應答的重要性。

綜上，固有免疫在抗瘧免疫防御中的作用越來越受到關注。固有免疫重要的執(zhí)行細胞—巨噬細胞在抗紅內(nèi)期瘧疾感染中的作用不容忽視。本研究通過鼠瘧模型證實巨噬細胞對控制紅內(nèi)期感染具有重要作用。如何調控巨噬細胞的生物學活性，進而有效地干預和控制紅內(nèi)期感染，有待我們進一步深入探討。

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