腹瀉病人隱孢子蟲及其他原蟲感染糞樣檢測(cè)分析＊

陳韶紅，艾 琳，田利光，張永年，童小妹，李 浩，陳家旭

腸道原蟲是導(dǎo)致人體腹瀉的主要原因之一。臨床上引起腹瀉的常見腸道原蟲病有溶組織阿米巴病、隱孢子蟲病、藍(lán)氏賈第蟲病等。但近年來，人群隱孢子蟲的感染率正逐步上升，由隱孢子蟲（cryptosporidium）引起的腹瀉逐步增多，我國(guó)腹瀉病人中隱孢子蟲的感染率為0．32%～15．22%［1－2］。自1976年我國(guó)報(bào)道人隱孢子蟲感染后，發(fā)現(xiàn)本病是引起旅游者腹瀉和夏季腹瀉的常見病原，多數(shù)表現(xiàn)為慢性腹瀉，主要見于免疫功能缺陷者，特別是艾滋病患者中?，F(xiàn)臨床上檢測(cè)糞便中隱孢子蟲感染的病原學(xué)方法主要為改良抗酸染色法和熒光染色法［3－5］。隨著免疫和分子檢測(cè)技術(shù)的推廣，免疫測(cè)定法和PCR技術(shù)在檢測(cè)原蟲感染上取得了很大的進(jìn)展［6－9］，本文將經(jīng)典的傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)運(yùn)用ELISA法、免疫試條法和FTA巢式PCR法，對(duì)臨床109例腹瀉病人進(jìn)行隱孢子蟲及其他原蟲感染情況進(jìn)行糞樣檢測(cè)分析，進(jìn)而為該病的診斷、防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 0．9%生理鹽水；2．5%碘液；改良抗酸染色試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司BA－4091）；金胺酚染色試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司BA－4018）；隱孢子蟲糞抗原檢測(cè)ELISA試劑盒（德國(guó)－R－Biopharm公司）；隱孢子蟲糞抗原快速檢測(cè)條（德國(guó)－R－Biopharm 公司）。FTA 卡（Whatman公司）；FTA 卡洗液 TE buffer（0．01mol／L Tris－HCl，pH 8．0；0．1mmol／L EDTA）（Whatman公司）；2×TaqPCR Master Mix（0．1UTaq Polymerase／L、500mol／L dNTP、20mmol／L Tris－HCl （pH8．3）、100mmol／L KCl、3mmol／L MgCl2、其它穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑）由上海生工生物制品有限公司提供；TAE電泳緩沖液（儲(chǔ)備液50×），使用時(shí)稀釋成（0．5×）即可。

1．2 主要儀器 PCR儀（美國(guó)ThermoPX2）；凝膠分析成像系統(tǒng)（Bio－RAD公司 Quantity on 4．6．6）；低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；直徑6mm打孔機(jī)（Whatman公司）；OLYMPUS BX51顯微鏡。

1．3 隱孢子蟲引物合成 第一輪PCR引物為Ex－Cry1Fa（正向）引物序列為TTCTAGAGCTAATACATGCG（5′－3′），ExCry2Rb（反向）引物序列為CCCACTTCTTCGAAGCAGGA，擴(kuò)增片段大小為1 330bp；第二輪PCR引物為NesCry3Fa（正向）引物序列為GAAGGGTTGTATTTATTAGATAAA（5′－3′），NesCry Rb（反向）引物序列為 CTCATAAGGTGCTGAAGGAGTA；擴(kuò)增片段大小為830bp。

1．4 糞便來源 2011年本所檢測(cè)中心腸道門診送檢腹瀉病人糞便109例，其中男性65人，女性44人，年齡在6～65歲，20名上海交通大學(xué)學(xué)生體檢糞便作為正常人對(duì)照。

1．5 直接涂片法 滴1滴生理鹽水于潔凈的載玻片中央，用棉簽或牙簽挑取綠豆大小的糞便，在生理鹽水中調(diào)勻，剔除粗大的顆粒和纖維，涂抹成邊緣整齊的橢圓形糞膜，鏡檢。

1．6 碘液染色法 在生理鹽水直接涂片上加蓋玻片，然后從蓋玻片一側(cè)滴1滴碘液，待其滲入后觀察；或在同一載玻片上，一側(cè)作生理鹽水直接涂片，另一側(cè)作碘液涂片，分別檢查滋養(yǎng)體和包囊。

1．7 改良抗酸染色法 滴加A液于糞膜，數(shù)分鐘后自來水緩慢沖洗；滴加B液于糞膜上，脫色至粉紅色為止，自來水緩慢沖洗；滴加C液于糞膜上，1min后自來水緩慢沖洗，自然干燥，油鏡檢查。

1．8 金胺酚染色法 空氣干燥糞便涂片，甲醇固定，金胺酚染液染色10min，自來水漂洗，3%酸性甲醇脫色，0．1%高錳酸鉀復(fù)染30min，空氣干燥，熒光顯微鏡鏡檢。

1．9 隱孢子蟲糞抗原的ELISA法 在試管中加入1mL樣品稀釋液，取固態(tài)糞便取約50mg置入稀釋液中混勻（若液體糞便則取100μL），靜置數(shù)分鐘后，取上清液直接用于檢測(cè)，在微孔反應(yīng)板中加入100μL糞便樣本的上清液，之后在每個(gè)微孔中加入100μL酶標(biāo)記抗體，室溫孵育60min，洗滌液洗5次，加入100μL的底物，避光孵育15min后，加終止液50μL終止反應(yīng)。同時(shí)設(shè)有陰性和陽性質(zhì)控。在酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm讀取OD值。判斷標(biāo)準(zhǔn)：檢測(cè)值／陰性參考值（P／N）≥2．0為陽性臨界值。

1．10 隱孢子蟲糞抗原快速試條法 在試管內(nèi)加1mL糞抗原提取液，加入50mg固態(tài)糞便樣本（若液態(tài)糞便取100μL），沉淀3min，取200μL上清液置于另一干凈試管中，浸入檢測(cè)條，5min后讀取結(jié)果。結(jié)果判斷：從糞便樣本吸收側(cè)開始依次出現(xiàn)：一條紅色檢測(cè)帶，一條藍(lán)色質(zhì)控帶，隱孢子蟲陽性可見藍(lán)帶和紅帶；隱孢子蟲陰性，僅見藍(lán)帶。

1．11 FTA巢式PCR法 用FTA卡提取隱孢子蟲DNA，進(jìn)行巢式PCR

1．11．1 初始PCR（Primary PCR） 反應(yīng)體系為DNA模板 （制得的FTA濾膜片1片）；2×Taq PCR Master Mix 50μL；1%BSA 4μL；10μmol／L引物各2．5μL；ddH2O 41μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1min，54℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1℃330bp。

1．11．2 巢式 PCR （Nested PCR） 反應(yīng)體系為DNA模板 （第一輪PCR產(chǎn)物）1μL；2×Taq PCR MasterMix 50μL；10μmol／L引物各5μL；ddH2O 39μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，94℃變性1 min，58℃退火45s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸8min。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為830bp。

PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳凝膠電泳鑒定。結(jié)果判斷：隱孢子蟲PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為830bp。

1．12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SAS 9．1軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié) 果

2．1 109例腹瀉病人隱孢子蟲及其他原蟲的感染情況 109例腹瀉病人中男性為65人，女性為44人，年齡在6～65歲，原蟲檢出陽性率為45%（49／109），感染對(duì)男女性別之間感染無顯著性差別，（χ2＝1．1901，P＝0．2753，P＞0．05）；兒童和成年之間感染無顯著性差別（χ2＝1．0247，P＝0．3144，P＞0．05）。

用直接涂片加碘液染色法檢測(cè)隱孢子蟲感染的陽性率為5．5%，溶組織阿米巴原蟲感染的陽性率為2．8%，人芽囊原蟲感染的陽性率為34．9%，未查見藍(lán)氏賈第鞭毛蟲；用改良抗酸加金胺酚染色法（圖1，2）檢測(cè)隱孢子蟲的陽性率為8．3%，微孢子蟲陽性率為1．8%；隱孢子蟲ELISA試劑盒檢測(cè)隱孢子蟲的陽性率為6．4%；免疫試條法（圖3）檢測(cè)隱孢子蟲的陽性率為1．8%；巢式PCR法檢測(cè)隱孢子感染的陽性率為9．1%；同時(shí)用5種方法檢測(cè)隱孢子蟲都為陽性的病例只有4例，其余的表現(xiàn)為單項(xiàng)或2項(xiàng)陽性，正常人對(duì)照都為陰性；引起腹瀉的原蟲主要是人芽囊原蟲、隱孢子蟲和少量的阿米巴原蟲及微孢子蟲（表1）。

表1 腹瀉病人隱孢子蟲及其他原蟲的感染情況Tab．1 Cryptozoite and other protozoon infection situation from stool of diarrhea patients

圖1 隱孢子蟲改良抗酸染色×100Fig．1 Modified acid－fast stain of Cryptosporidium （×100）

2．2 隱孢子蟲巢式PCR測(cè)序結(jié)果 109例臨床腹瀉病人經(jīng)巢式PCR檢測(cè)隱孢子蟲感染陽性率為9．1%，10例感染者糞便樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與GenBank中隱孢子蟲的序列比對(duì)，為微小隱孢子蟲（Cryptosporidiumparvum）和貓隱孢子蟲（Cryptosporidiumfelis）感染（表2），各樣本間序列差異結(jié)果比對(duì)如圖4。

圖2 隱孢子蟲金胺酚染色×100Fig．2 Auramine phenol staining of Cryptosporidium （×100）

圖3 試紙條檢測(cè)隱孢子蟲糞抗原（1，2為陽性，3為陰性）Fig．3 Colloidal gold test paper of fecal antigen of Cryptosporidium1，2：Positive；3：negative．

表2 隱孢子蟲感染者糞便樣品PCR測(cè)序結(jié)果Tab．2 PCR and sequencing results of Cryptosporidiuminfection by stool samples

圖4 序列比對(duì)結(jié)果Fig．4 Results of sequence alignment

3 討 論

人體腸道感染性腹瀉大多是由細(xì)菌、病毒引起，但近年來由腸道寄生原蟲引起的腹瀉逐漸增多，腸道寄生原蟲屬于原生動(dòng)物亞界，廣泛分布于自然界的各種生態(tài)環(huán)境中，不少原蟲既可感染人類，又寄生于一些動(dòng)物，大多以水作為主要傳播載體，是引起腹瀉的主要病原體之一。其致病性除了與原蟲的種類、寄生數(shù)量及毒力有關(guān)外，還與個(gè)體免疫機(jī)能狀態(tài)有關(guān)系。

從2011年本所檢測(cè)中心門診的109例腸道腹瀉病人糞樣的檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)寄生原蟲的蟲種主要為人芽囊原蟲、隱孢子蟲、溶組織內(nèi)阿米巴原蟲和少量的微孢子蟲感染，其中人芽囊原蟲的感染率最高達(dá)到34．9%，說明人芽囊原蟲普遍易感，這與地理氣候、衛(wèi)生條件、飲食習(xí)慣、營(yíng)養(yǎng)狀況和精神壓力度有關(guān)［10］；從感染阿米巴原蟲的患者情況分析，由于多數(shù)溶組織內(nèi)阿米巴感染者臨床癥狀不顯著［11］，這些慢性病人除腹瀉外都無明顯的膿血便，僅表現(xiàn)為稀爛便或蛋花樣便，因此，臨床上應(yīng)多注意反復(fù)多次檢測(cè)，否則非常容易漏診；近年來，隱孢子蟲病在發(fā)達(dá)國(guó)家和發(fā)展中國(guó)家的腹瀉病人中呈反復(fù)上升趨勢(shì)，對(duì)于隱孢子蟲的診斷，病原學(xué)檢查簡(jiǎn)單方便，但檢出率低；而免疫學(xué)檢查法能提高敏感性，但對(duì)抗原要求較高，且很難區(qū)分既往感染和現(xiàn)癥感染，而隱孢子蟲的檢測(cè)主要是針對(duì)糞抗原，免疫酶法和免疫印跡的檢出率相對(duì)較底。目前采用分子生物學(xué)檢測(cè)具有提高敏感性和特異性［12］，但要一定的儀器設(shè)備與試劑，檢測(cè)費(fèi)用較高，因此，我們同時(shí)采用多種聯(lián)合檢測(cè)手段進(jìn)行互補(bǔ)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)法有利于提高隱孢子蟲的陽性檢出率，其中以巢式PCR法的檢出率最高，經(jīng)測(cè)序分析，病人感染的隱孢子蟲為人隱孢子蟲和貓隱孢子蟲，這可能與患者的飲食習(xí)慣和現(xiàn)在盛行的家庭飼養(yǎng)寵物有關(guān)。

臨床上免疫功能正常的患者，隱孢子蟲感染后常表現(xiàn)為“自限性腹瀉”，有癥狀者以腹痛、稀便、水樣便多見，若在抗生素治療無效或低效時(shí)，應(yīng)考慮隱孢子蟲感染。有研究者曾對(duì)上海某地區(qū)的人群進(jìn)行隱孢子蟲感染調(diào)查，正常無腹瀉人群中隱孢子蟲感染率在4．8%［13］，結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果分析，在腹瀉病人中除人牙囊原蟲感人率較高外，其次就為隱孢子蟲，我們?cè)诟篂a病人中發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲感染率高達(dá)8．3%～9．1%。由于目前臨床上未采用聯(lián)合檢測(cè)法，大多用的是直接涂片或抗酸染色，十分容易漏檢，預(yù)示隱孢子蟲在腹瀉病人中的感染率將更高。

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