人棘球蚴病血清學(xué)診斷試劑檢測效能評價(jià)＊

王立英，田 添，伍衛(wèi)平，曹建平

棘球蚴?。╡chinococcosis）是由帶科棘球?qū)俚募蚪{蟲的幼蟲寄生所致的人獸共患寄生蟲病，俗稱包蟲?。╤ydatidosis）。該病潛伏期較長，早期無明顯臨床癥狀，所以多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)便是中晚期，給治療帶來很大困難。血清學(xué)診斷是進(jìn)行人群篩檢、早期發(fā)現(xiàn)患者的重要手段［1］。為了解我國現(xiàn)有血清學(xué)診斷試劑現(xiàn)狀，為全國中央轉(zhuǎn)移支付地方棘球蚴病防治項(xiàng)目進(jìn)行人群血清流行病學(xué)調(diào)查與監(jiān)測，篩選適宜的檢測試劑提供參考。中央補(bǔ)助地方棘球蚴病防治項(xiàng)目辦公室對現(xiàn)有的棘球蚴病血清學(xué)診斷試劑檢測效能進(jìn)行評價(jià)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 標(biāo)本血清 共收集400份，其中陽性標(biāo)本血清288份。其中186份為手術(shù)診斷病例，手術(shù)病人血清要求術(shù)前采血或術(shù)后3天內(nèi)進(jìn)行采血；其余102份為臨床診斷病例，即具有棘球蚴病典型影像特征，用B超進(jìn)行了明確診斷分型，而且用2種以上血清學(xué)方法同時(shí)進(jìn)行輔助診斷為陽性的病例。陽性血清中包括囊型包蟲病病人血清191份，其中100份來自新疆自治區(qū)，另外91份來自青藏高原地區(qū)；泡型包蟲病病人血清95份，來自青藏高原；混合型包蟲病病人血清2份，來自青藏高原。陰性血清72份，為采自棘球蚴病非流行區(qū)的正常人血清。另外，為考察檢測試劑的交叉反應(yīng)性，收集確診囊蟲病病人血清40份，其中29份來自山東、11份來自河南。

所有測試用標(biāo)本血清均及時(shí)嚴(yán)格按要求進(jìn)行處理保存，在測試前未經(jīng)反復(fù)凍融。

1．2 參評試劑 在全國范圍內(nèi)收集已經(jīng)應(yīng)用于防治實(shí)踐或者實(shí)驗(yàn)室研制比較成熟的血清學(xué)診斷試劑，同時(shí)收集參評試劑的有關(guān)信息，包括試劑盒／方法名稱、免疫學(xué)方法、個(gè)體檢測所需血清量、檢測所需特殊試劑或儀器設(shè)備、單價(jià)、年產(chǎn)量等信息。最后共確定相對較優(yōu)的9種試劑參加測評。

1．3 方法

1．3．1 組織方法 本次測評遵循公開、公平、公正的原則。采用雙盲法進(jìn)行測評，即測評工作小組人員和參加測試人員均不知道待測血清的真實(shí)信息。由項(xiàng)目辦公室人員預(yù)先建立待測血清原始數(shù)據(jù)庫，將所有血清樣本信息錄入后進(jìn)行隨機(jī)編號，將編號后的待測血清序號交給測評工作小組作為本次測試樣本的原始序號，然后由測評工作小組組織人員按照參評試劑的血清用量對400份待測血清樣本進(jìn)行分裝，共分成A、B、C、D、E、F、G、H、I共9組，為體現(xiàn)公平對每組血清采用不同隨機(jī)數(shù)字編號。分裝好之后進(jìn)行集中封存。

1．3．2 檢測方法 測評工作小組負(fù)責(zé)提供各參評單位提出的測評所需的場地要求和設(shè)備條件。每種試劑由各試劑公司或研制單位的專門技術(shù)人員隨機(jī)抽取組號，嚴(yán)格按照試劑說明書要求進(jìn)行各自的規(guī)范化檢測操作。血清用量：A～F為10mL；G～J為20mL。

1．3．3 質(zhì)量控制 成立由非參評單位人員組成的測評工作小組，負(fù)責(zé)測評工作的組織實(shí)施和測試現(xiàn)場監(jiān)督工作。測評工作小組的核心機(jī)構(gòu)為試劑測評評委會，由3人組成。其中來自試劑采購使用方的代表兩人，非試劑生產(chǎn)方亦非試劑使用方的第三方代表一人。測評開始前，評委會主席宣讀測評程序和注意事項(xiàng)。每種測評試劑以抽簽方式分配測試樣本和工作臺。評委會每人隨機(jī)抽取3個(gè)組負(fù)責(zé)測試監(jiān)考工作，并記錄每個(gè)組測出的有效樣本數(shù)、所用人時(shí)數(shù)、以及相關(guān)大型設(shè)備的使用情況等。對照有關(guān)試劑的技術(shù)指標(biāo)全程考察，對測試結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，必要時(shí)重復(fù)進(jìn)行測試。各參評單位的實(shí)驗(yàn)操作人員記錄測試結(jié)果，結(jié)果只能為陽性或者陰性，沒有結(jié)果的樣本數(shù)原則上不得多于2%，否則結(jié)果作廢。測試結(jié)束，測試人員認(rèn)真核對結(jié)果簽字后送至測評工作小組，在測試人員的監(jiān)督下，由工作組人員采取一人錄入、兩人核對的方式將數(shù)據(jù)按每個(gè)組的順序錄入測試結(jié)果數(shù)據(jù)庫。同時(shí)對各組的原始記錄結(jié)果進(jìn)行封存，由本次測評主辦單位棘球蚴病項(xiàng)目防治辦公室歸檔。

1．3．4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)錄入后，由項(xiàng)目辦公室人員用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算了反映試劑檢測效能的有關(guān)指標(biāo)：敏感性、特異性、正確指數(shù)、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致率以及與囊蟲病的交叉反應(yīng)率。由于參評的試劑中目前還沒有較為成熟的可以區(qū)分囊型包蟲病和泡型包蟲病的檢測試劑，所以沒有進(jìn)行分型統(tǒng)計(jì)。另外，每種試劑對于不同來源的囊型包蟲病病人血清的檢測結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以沒有區(qū)分標(biāo)本血清來源地進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。以試劑A的檢測結(jié)果為例（表1），各項(xiàng)指標(biāo)的計(jì)算方法如下。

表1 試劑A的檢測結(jié)果Tab．1 The result of reagent A

靈敏度＝A／（A＋C）＝255／288×100%＝88．5%；

特異度＝D／（B＋D）＝66／72×100%＝91．7%；

陽性預(yù)測值＝A／（A＋B）＝255／261×100%＝97．7%；

陰性預(yù)測值＝D／（C＋D）＝66／99×100%＝66．7%；

正確指數(shù)＝靈敏度＋特異度－1＝0．802；

一致性＝［A×（B＋D）＋D×（A＋C）］／［2×（A＋C）×（B＋D）］＝90．1%（考慮到陽性樣本與陰性樣本的數(shù)量不同，對此指標(biāo)的計(jì)算進(jìn)行了加權(quán)調(diào)整，更能綜合反映敏感性和特異性）；

囊蟲病交叉反應(yīng)率＝E／（E＋F）＝19／40×100%＝47．5%。

2 結(jié) 果

共有9種棘球蚴病血清學(xué)診斷試劑參加了本次測評。方法包括ELISA、IHA、金標(biāo)層析法、免疫層析試條、膠體金滲濾法等多種方法。各試劑的檢測結(jié)果見表2。如用“正確指數(shù)”評價(jià)，試劑A（ELISA間接法）的檢測效能最高。

表2 人棘球蚴病9種血清學(xué)診斷試劑檢測效能比較（%）Tab．2 The comparison of nine serological diagnostic reagents of human echinococcosis（%）

3 討 論

棘球蚴病患者的血清學(xué)診斷是進(jìn)行患者早期診斷的重要手段，是對患者實(shí)施有效處理和治療的一個(gè)先決條件［1］。檢測抗棘球蚴血清抗體的血清學(xué)試驗(yàn)中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（檢測IgG）（IgG－ELISA），間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)（IHAT），和膠乳凝集試驗(yàn)（LAT），在實(shí)驗(yàn)室中普遍使用［2］；用得較少的是免疫熒光抗體試驗(yàn)（IFAT），免疫電泳法（IEP）和一些其他試驗(yàn)。但在棘球蚴病的抗體檢測中，還沒有標(biāo)準(zhǔn)化的、高度敏感、特異的血清學(xué)試驗(yàn)［3］。我國自2005年啟動(dòng)了中央轉(zhuǎn)移支付棘球蚴病防治項(xiàng)目，包括人群篩查的血清學(xué)診斷和兒童血清學(xué)監(jiān)測等內(nèi)容，由于對目前應(yīng)用的血清學(xué)診斷試劑缺乏了解，直接影響項(xiàng)目的效果考核和數(shù)據(jù)利用。

通過本次評價(jià)，了解了我國人群棘球蚴病血清學(xué)診斷試劑的現(xiàn)狀和檢測效能。主要特點(diǎn)如下。3．1 總體來講各診斷試劑檢測效能不夠理想。表現(xiàn)為敏感性、特異性較低。9種試劑平均正確指數(shù)僅0．56，平均調(diào)整一致性為77．9%。試劑A相對較好，敏感性88．5%，特異性91．7%，正確指數(shù)為0．802，一致性為90．1%，加強(qiáng)該診斷試劑的研發(fā)，提高檢測效能是我國棘球蚴病防治中亟待解決的問題。應(yīng)注意的是，有多種因素影響試驗(yàn)結(jié)果，如抗原質(zhì)量、檢測系統(tǒng)、包囊的器官定位和包囊數(shù)量、免疫應(yīng)答個(gè)體差異等。

3．2 方法多樣，檢測效率相對較高的為ELISA方法。本次參評的試劑從診斷方法的角度包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）、間接血凝法（IHA）、免疫層析法和金標(biāo)滲濾法。綜合考慮真實(shí)性相關(guān)指標(biāo)，認(rèn)為目前檢測效能相對較高的為ELISA法。在方法上，試驗(yàn)應(yīng)該具有高度敏感性和特異性。這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)病例是無癥狀的，可能性更大的是尚處于病變早期，如小型、單房的、泡狀包囊或鈣化包囊等，這些情況下的血清反應(yīng)性很低［4］。但考慮現(xiàn)場應(yīng)用的可行性，免疫層析試條等快速簡便的方法將成為未來的研究方向。

3．3 普遍存在較強(qiáng)的與囊蟲病的交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)最低的為25．0%，最高達(dá)82．5%。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，交叉反應(yīng)將會進(jìn)一步降低。

3．4 鑒別AE和CE的能力差。9種參評試劑中只有兩種試劑在設(shè)計(jì)上能夠區(qū)分AE和CE，但是檢測效果很不理想，最后尊重廠家意愿按不分型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所以目前我國沒有較為成熟的鑒別AE和CE的診斷試劑。而據(jù)報(bào)道，在2000年有一種蛋白印跡試驗(yàn)已經(jīng)商品化（棘球絳蟲 WB IgG，LDBIO診斷，里昂，法國），可鑒別AE和CE，具有大約76%的可靠性［5］。

試劑評價(jià)同樣應(yīng)從試劑的真實(shí)性、可靠性兩個(gè)方面入手。本次只評價(jià)了真實(shí)性的一系列指標(biāo)，由于參評試劑較多，血清用量較大，未能進(jìn)行平行樣重復(fù)試驗(yàn)評價(jià)試劑的可靠性，下一步欲選擇真實(shí)性相對較好的幾種試劑，檢測同一批次的同一酶標(biāo)板內(nèi)和不同的酶標(biāo)板之間以及不同批次之間的穩(wěn)定性、以對試劑的檢測效能做出更全面的評價(jià)。

［1］Sato N，Namieno T，F(xiàn)uruya K，et al．Contribution of mass screening system to respectability of hepatic lesions involvingE－chinococcusmultilocularis［J］．J Gastroenterol Hepatol，1997，32：351－354．

［2］Guisantes JA．Progress on the laboratory diagnosis of the human hydatid disease－－from the recent past till the present［J］．Arch Int Hidatid，1997，32：136－140．

［3］Craig PS．Immunodiagnosis ofEchinococcusgranulosusand a comparison of techniques for diagnosis of canine echinococcosis．InCompendiumon cystic echinococcosis in Africa and Middle Eastern countries with special reference to Morocco［M］．F．L．Andersen，H．Ouhelli，M．Kachani，eds．Provo：Print Services，Brigham Young University，1997：85－118．

［4］Craig PS，Rogan MT，Allan JC，et al．Detection，screening and community epidemiology of taeniid cestode zoonoses：cystic echinococcosis，alveolar echinococcosis and neurocysticercosis［J］．Adv Parasitol，1996，38：169－250．

［5］Piarroux R，Janin V，Bresson－Hadni S，et al．Diagnostic value of a western blot using crude larval antigen fromEchinococcus multilocularis［J］．Acta Parasitol，2000，45：196．