廣西新分離流行性乙型腦炎病毒GP0722株全基因組分子特性研究＊

閉福銀，謝藝紅，譚 毅，楊進業(yè)

廣西新分離流行性乙型腦炎病毒GP0722株全基因組分子特性研究＊

閉福銀，謝藝紅，譚 毅，楊進業(yè)

目的對廣西新分離乙腦病毒GP0722株進行全基因序列測定和分析，了解其基因組結(jié)構(gòu)及毒力特征。方法應(yīng)用乙腦病毒全基因組擴增引物進行RT－PCR擴增，PCR產(chǎn)物直接測序，拼接后得到全基因序列。應(yīng)用Clustal X（1．8）、DNASTAR、Mega 4．1等生物軟件進行核苷酸序列及氨基酸序列分析和病毒的系統(tǒng)進化分析。結(jié)果廣西新分離乙腦病毒GP0722全基因長10 965個核苷酸，從97到10 395位編碼一個開放閱讀框，編碼3 432個氨基酸，與目前使用的減毒活疫苗株SA－14－14－2株比較，只有88．9%的核苷酸同源性，97．6%的氨基酸同源性，全基因組共存在1 222個核苷酸差異，83個氨基酸差異。與GenBank中選擇的21株乙腦病毒全基因序列比較發(fā)現(xiàn)，其核苷酸總體差異率為0．9%～18．8%，氨基酸總體差異率為0．1%～5．2%。通過Pr M／C區(qū)段、E區(qū)段、3′NTR區(qū)段和全基因序列進行系統(tǒng)進化分析顯示該毒株屬于基因1型乙腦病毒。結(jié)論新分離的乙腦病毒GP0722株屬于基因1型，與JEV／sw／Mie／40／2004進化關(guān)系最近，與疫苗株SA－14－14－2相比關(guān)鍵位點氨基酸未見變異，現(xiàn)行使用的疫苗仍能保護GP0722引起的感染。

乙型腦炎病毒；基因；種系發(fā)生

流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis，JE，乙腦），是由乙腦病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）感染引起的經(jīng)蚊蟲傳播的人獸共患急性傳染病。乙腦患者的病死率高，幸存者中約30% 的人會留有不同程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［1－2］。

乙腦屬于黃病毒科黃病毒屬，基因組為約11kb的單股正鏈RNA，5′端有1型帽子結(jié)構(gòu)，3′端不含poly尾?；蚪M只有一個開放讀碼框，主要編碼3個結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白、膜蛋白、囊膜蛋白E）和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5），基因組5′末端包括95個核苷酸，3′末端包括586個核苷酸［3］。

乙腦主要在中國、日本和越南等亞洲國家和地區(qū)流行，近年來乙腦的流行區(qū)域不斷擴大［4］，目前全世界約20余個國家存在乙腦流行，我國為乙腦的高發(fā)區(qū)，平均年發(fā)病數(shù)約占全世界乙腦病例的80%以上［5］。

廣西從1950年開始有乙腦病例報告，報告顯示廣西20世紀(jì)60年代初期至70年代中期乙腦發(fā)病率呈上升并維持在較高水平，至90年代后開始呈下降趨勢［6－7］，特別是近年來廣西將乙腦納入計劃免疫管理，疫情進一步得到控制，但每年還有幾十例的病例報告，因此，了解廣西乙腦的分子生物學(xué)特征，對乙腦防控非常必要。

1 材料和方法

1．1 毒株背景2007年從桂平三帶喙庫蚊中分離到乙腦病毒GP0722株。

1．2 病毒RNA的提取及全基因組序列測定 取病毒培養(yǎng)物，High Pure Viral RNA Kit（Roche，德國）試劑盒提取核酸。引物序列參照文獻［8］，由上海生工生物科技有限公司合成，RT－PCR試劑使用QIAGEN OneStep RT－PCR Kit（Qiagen，德國）。

1．3 病毒核苷酸及氨基酸序列分析 使用DNAstar軟件包中的Seq Man對序列片段進行拼接、編輯、校正。堿基配對由Clustal X1．8軟件完成，核苷酸及氨基酸序列同源性和差異度分析由DNAstar軟件包中的Meg Align軟件完成。

1．4 病毒株的進化分析 對GP0722株及目前GenBank登錄的、覆蓋基因1～4型的JEV全基因組序列，由Clustal X1．8軟件進行病毒核苷酸序列聯(lián)配，選擇莫雷山谷熱病毒 MVE為外群，用MEGA4．1軟件中的Neighbor－Joining方法進行序列分析，獲得最終的系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié) 果

2．1 GP0722株全基因組序列 將所得的PCR產(chǎn)物進行雙向測序，拼接后得到病毒的全基因序列。病毒基因組全長10 965個核苷酸，5′非編碼區(qū)包括96個核苷酸，開放閱讀框從97至10 395，共10 296個核苷酸，編碼3 432個氨基酸，3′非編碼區(qū)包括570個核苷酸。

2．2 GP0722株與減毒活疫苗株序列比較分析與減毒活疫苗株SA14－14－2相比，全基因組核苷酸差異率為11．14%，共存在1 222個核苷酸差異，氨基酸差異率為2．42%，存在83個氨基酸差異。其中非結(jié)構(gòu)基因NS2的核苷酸的差異率最高為12．53%，5′端非編碼區(qū)的差異率最低為3．13%；非結(jié)構(gòu)基因NS2的氨基酸差異率最高為3．69%，非結(jié)構(gòu)基因NS3的氨基酸差異率最低為1．45%（表1）。在結(jié)構(gòu)基因中共有24個氨基酸的差異，其中7個在衣殼基因，3個在膜基因，14在囊膜基因（表2）。

表1 乙腦毒株GP0722與減毒活疫苗株SA14－14－2之間基因組比較分析Tab．1 Genome sequence analysis of the GP0722 compared with vaccine strain SA14－14－2

2．3 GP0722株與其他乙腦毒株全基因組序列核苷酸及氨基酸差異分析 將GP0722株與GenBank中選取的其他國家和地區(qū)分離的覆蓋4個基因型別的21株乙腦毒株的全基因核苷酸及氨基酸序列進行同源性分析，GP0722株與其他毒株的核苷酸總體差異率為0．9%～18．8%，氨基酸總體差異率為0．1%～5．2%。其中 GP0722株與JEV／sw／Mie／40／2004株的核苷酸差異率最低為0．9%，與JKT6468株核苷酸差異率最高為18．8%；與JEV／sw／Mie／40／2004氨基酸同源性最高為99．9%，與JKT6468氨基酸同源性最低為94．8%。

2．4 系統(tǒng)進化分析 將GP0722株與21株乙腦病毒株的Pr M／C區(qū)段、E基因區(qū)段、3′NTR區(qū)段及全基因序列進行核苷酸聯(lián)配后，進行進化分析，選擇1株莫雷山谷熱病毒作為外群。4種分析方法均可以看到明顯的4個基因型別，其中基因1型7株，基因2型1株，基因3型13株，基因4型1株，4種分析方法均顯示新分離的乙腦病毒GP0722株在基因1型中（圖1）。

3 討 論

自從乙型腦炎被證實在中國流行以來，國內(nèi)各地分離到了大量的乙腦病毒株并進行了一定的研究，但大多集中在于高變異的Pr M／C區(qū)段［9］，基于不同的地理來源將乙腦病毒分為4個基因型。本研究對2007年在廣西桂平市捕捉的三帶喙庫蚊標(biāo)本中新分離的乙腦病毒株GP0722株進行全基因組序列測定，對病毒基因進行了Pr M／C區(qū)段、E區(qū)段、3′NTR區(qū)段和全基因序列進化分析，結(jié)果完全一致。

圖1 分離自不同國家的22株乙腦病毒的全基因序列系統(tǒng)進化分析MAV：莫雷山谷熱病毒縮寫，作為進化分析的外群；A：全基因；B：E區(qū)段；C：Pr M／C；D：3′NTR區(qū)段Fig．1 Phylogenetic tree based on the full－length genome of genetic relationships among 22 JE virus strains MVE sered as outgroup；A：Full－length；B：E；C：Pr M／C；D：3′NTR

表2 乙腦病毒GP0722株與減毒活疫苗株SA14－14－2結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸差異分析Tab．2 Amino acid substitutions in JEV stains（GP0722）structural proteins compared with vaccine strain SA14－14－2

減毒活疫苗株SA14－14－2是目前國內(nèi)擴大免疫規(guī)劃廣泛使用的疫苗株，分析比較新分離株與其全基因組序列對了解疫苗對該地區(qū)乙腦流行的保護具有重要的意義，E蛋白是流行性乙型腦炎的主要抗原成分，具有特異性中和及血凝抑制抗原決定簇，E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ 是重要的抗原表位，其中主要集中在E337－345，E377－382 和 E397－403 這 3 個 區(qū) 域［10］。本次研究結(jié)果顯示GP0722株和疫苗株SA14－14－2在這3個區(qū)域完全一致，本研究結(jié)果從分子角度證實了減毒活疫苗株SA14－14－2株能保護GP0722株引起的感染。另一方面，對TBE病毒的研究發(fā)現(xiàn)E306是決定黃病毒對鼠腦神經(jīng)侵入力的關(guān)鍵位點［11］；對病毒神經(jīng)侵入力研究認為，E52和E270位氨基酸可影響病毒進入宿主細胞，從而降低病毒神經(jīng)侵入力［12－13］；對病毒神經(jīng)毒力的研究還認為，當(dāng)乙腦病毒E138位的氨基酸由谷氨酸替換成賴氨酸后病毒的神經(jīng)毒力會有明顯的降低［14］；通過比較發(fā)現(xiàn)，GP0722的 E52、E270和 E306與 SA14－14－2一致，E138位點氨基酸為谷氨酸，說明GP0722神經(jīng)毒力未發(fā)生明顯降低。

廣西位于我國西南端，全年平均氣溫16℃～22．7℃之間，氣候濕潤，雨水豐富，適合各種媒介昆蟲的繁殖，并且廣西與蟲媒病毒高發(fā)的地區(qū)廣東、云南、越南等省毗鄰，隨著南寧成為東盟博覽會永久舉辦地，各地區(qū)的經(jīng)貿(mào)合作頻繁，以及廣西旅游業(yè)的快速發(fā)展，廣西存在著各種蟲媒病毒病暴發(fā)的風(fēng)險相當(dāng)高。因此，加強廣西蟲媒病毒的研究非常有必要。本研究對2007年在桂平市采集的蚊蟲標(biāo)本中分離的乙腦病毒進行的全基因組序列測定，分析了其分子生物學(xué)特性，為預(yù)防和控制乙腦在當(dāng)?shù)氐牧餍刑峁┝朔肿恿餍胁〉目茖W(xué)依據(jù)。

［1］Gould EA，Solomon T．Pathogenic flaviviruses［J］．Lancent，2008，371：500－509．

［2］Solomon T，Ni H，David W C，et al．Origin and evolution of Japanese encephalitis virus in southeast Asia［J］．J Virol，2003，77：3091－3098．

［3］自登云，陳伯權(quán)，俞永新．蟲媒病毒與蟲媒病毒?。跰］．昆明：云南科技出版社，1995：157．

［4］梁國棟．加強中國病毒性腦炎的檢測與研究［J］．中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2006，20（3）：201－202．

［5］王環(huán)宇，梁國棟．中國分離乙腦病毒與滅活疫苗株（P3株）E基因差異分析［J］．中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2006，20（1）：56－60．

［6］譚毅，謝藝紅，周開姣，等．1990－2007年廣西流行性乙型腦炎流行病學(xué)特征分析［J］．應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2008，14（6）：323－325．

［7］孟軍，楊進業(yè)，吳秀玲，等．廣西1992－2006年流行性乙型腦炎流行特征分析［J］．中國熱帶醫(yī)學(xué)，2007，7（8）：1422－1423．

［8］潘曉玲，梁國棟．乙腦病毒基因Ⅰ、Ⅲ型特異性全基因組引物［J］．中華實驗和臨床病毒學(xué)雜志，2009，23（4）：254－256．

［9］Chen WR，Tesh RB，Rico－Hesse R．Genetic variation of Japanese encephalitis virus in nature［J］．J Gen Virol，1990，71：2915－2922．

［10］Lobigs M，Uaha R．Host cell selection of murray valley encephalitis virus variants altered at an RGD sequence in the envelope protein and in mouse virulence［J］．Virology，1990，176：587－595．

［11］Rey FA，Heinz FX，Mandl C，et al．The envelope glycoprotein from tickborne encephalitis virus at 2 A resolution［J］．Nature，1995，375：291－298．

［12］Hasegawa H，Yoshida M，Shiosaka T，et al．Mutation in the envelope protein of Japanese encephalitis virus affect entry into cultured cells and virulence in mice［J］．Virology，1992，191：158－165．

［13］Cecilia D，Gould EA．Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutralizationresistant mutants［J］．Virology，1991，181：70－77．

［14］Ni H，Chang GJ，Xie H，et al．Molecular basis of attenuation of neurovirulence of wild－type Japanese encephalitis virus strain SA14［J］．J Gen Virol，1995，76：409－413．

Molecular characteristics of full－length genome of Japanese encephalitis virus strain（GP0722）newly isolated in Guangxi province

BI Fu－yin，XIE Yi－h(huán)ong，TAN Yi，YANG Jin－ye
（Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and Prevention，Nanning 530028，China）

In order to sequence and analyze the complete nucleotide sequence of Japanese encephalitis virus（JEV）strain GP0722 newly isolated in Guangxi province，and to provide information for the genomic structure and characteristics of virulence．RT－PCR was used to amplify the sequenced fragments directly and bioinformatics softwares were used to analyze the nucleotide，amino acid and phylogenetic trees of the strain including ClustalX（1．8），DNAStar，Mega（4．1）．The result of sequence analysis showed that the genome of GP0722 strain was 10 965 nucleotide long．An open reading frame from 97 to 10 395 was found capable of coding for a 3 432 amino acid polyprotein．Compared with the live attenuated vaccine strain SA14－14－2 in China，there were 1 222 nucleotide differences and 83 amino acid divergence．Comparison of the complete genome sequences of different JEV showed a 0．9%－18．8%nucleotide sequence divergence among them，which resulted in 0．1%－5．2%amino acid sequence divergence．Phylogenetic analysis through Pr M／C，E，3′NTR and full－length genome showed that the GP0722 strain belonged to genotype 1．In conclusion，the GP0722 strain isolated in Guangxi belonged to genotype 1 and is close to the JEV／sw／Mie／40／2004．There are no mutations．Vaccination can protect human from the infection of GP0722．

Japanese encephalitis virus；genes；phylogeny

R373

A

1002－2694（2012）03－0270－04

＊廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳計劃課題（No．Z2008204）

閉福銀，Email：bfy1980＠sina．com

廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，南寧 530028

2011－10－11

2012－01－16