蜱傳萊姆螺旋體跨物種傳播的信號(hào)調(diào)控＊

楊章女，朱函坪，蔣寶貴，徐海君，曹務(wù)春

2.中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院微生物流行病研究所，北京100071；

3.浙江大學(xué)昆蟲科學(xué)研究所 ，杭州 310058

萊姆?。↙D）是由硬蜱屬（Ixodes）傳播的自然疫源性疾病，其病原體是呈革蘭氏陰性的伯氏疏螺旋體（Borreliaburgdorferisensulato）。萊姆病可引起皮膚、關(guān)節(jié)、心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織等多系統(tǒng)感染，從而被世界衛(wèi)生組織列為應(yīng)重點(diǎn)防治研究的新發(fā)現(xiàn)傳染病之一。近年來(lái)，全球萊姆病的發(fā)生呈上升的趨勢(shì)，據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心公布，2009年全美已確診的萊姆病人達(dá)近3萬(wàn)例，另有約1萬(wàn)例疑似病例，主要分布在美國(guó)東北部的紐約、康涅狄格以及中部的威斯康辛等州。在我國(guó)，萊姆病的分布也相當(dāng)廣泛，在20多個(gè)省、自治區(qū)、直轄市都有報(bào)道，由于臨床癥狀復(fù)雜易于誤診，致殘率較高，已成為我國(guó)重要的蟲媒傳播疾病之一[1]。

萊姆螺旋體完成生活史需要進(jìn)化關(guān)系甚遠(yuǎn)的兩類動(dòng)物，即媒介蜱和哺乳動(dòng)物宿主（如鼠）。由于這兩類動(dòng)物擁有截然不同的生理生化內(nèi)環(huán)境，所以病原體的跨物種傳播機(jī)制一直是萊姆病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，也是疫苗開(kāi)發(fā)、疾病預(yù)防與控制的前期基礎(chǔ)。本文現(xiàn)就萊姆螺旋體的二元信號(hào)系統(tǒng)和非核心轉(zhuǎn)錄因子在病原體跨物種傳播時(shí)的信號(hào)調(diào)控研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1 Rrp2－RpoN－RpoS信號(hào)途徑

已有的研究表明，萊姆螺旋體的基因調(diào)控往往是轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，二元信號(hào)系統(tǒng)和非核心轉(zhuǎn)錄因子在這過(guò)程中扮演著重要的角色。在描述Rrp2－RpoN－RpoS這個(gè)信號(hào)途徑之前，我們先對(duì)萊姆螺旋體的兩個(gè)主要外膜蛋白（膜蛋白A和膜蛋白C）的研究進(jìn)展進(jìn)行概述，因?yàn)檎菍?duì)這兩個(gè)外膜蛋白的長(zhǎng)期探索，才導(dǎo)致了Rrp2－RpoN－RpoS信號(hào)途徑的發(fā)現(xiàn)。

早期的科研工作者對(duì)萊姆螺旋體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非常有趣的現(xiàn)象，不同的培養(yǎng)條件（如不同的pH和溫度）會(huì)極大地改變菌體膜蛋白的成分。在較高的溫度（約37。C）和較低的pH（pH≈7）條件下，螺旋體主要產(chǎn)生膜蛋白C；反之，較低的溫度（23。C）和較高的pH（pH≈8）則使螺旋體表達(dá)膜蛋白A，那么該現(xiàn)象對(duì)應(yīng)的生物學(xué)意義作何解釋呢？一種比較認(rèn)可的解釋是較高的溫度（約37。C）和較低的pH（pH≈7）條件模擬了哺乳動(dòng)物內(nèi)環(huán)境，而較低的溫度（23。C）和較高的pH（pH≈8）條件則更接近于蜱中腸內(nèi)環(huán)境。在過(guò)去的大概15年內(nèi)，大量的實(shí)驗(yàn)表明膜蛋白C具有以下這些特征和功能[2－8]：1）只有當(dāng)蜱刺吸哺乳動(dòng)物宿主時(shí)，膜蛋白 C的啟動(dòng)子被激活，引起膜蛋白C大量表達(dá)，在吸血后48h達(dá)到表達(dá)高峰，而它在螺旋體寄生蜱中腸及在蜱的蛻皮過(guò)程中不表達(dá)；2）膜蛋白C是病原體侵染哺乳動(dòng)物的關(guān)鍵致病因子，敲除膜蛋白C基因的螺旋體完全喪失了感染哺乳動(dòng)物宿主的能力，也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與萊姆病毒力直接相關(guān)的膜蛋白；3）膜蛋白C功能的缺損使萊姆螺旋體喪失了從蜱中腸到唾液腺體的遷移能力，從而切斷了感染哺乳動(dòng)物的途徑；4）膜蛋白C蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，早期萊姆病病人體內(nèi)存在著大量的膜蛋白C抗體。據(jù)報(bào)道，膜蛋白C抗體具有良好的免疫保護(hù)作用，但是由于膜蛋白C序列在不同地區(qū)間有較大的差異性，直接限制了其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。相反，研究表明膜蛋白A擁有與膜蛋白C完全不同的生物學(xué)功能[5，9－14]：1）膜蛋白 A 是病原體從哺乳動(dòng)物進(jìn)入蜱中腸后被誘導(dǎo)的膜蛋白，所以缺失膜蛋白A基因的病原體喪失了寄生蟲媒蜱的能力，膜蛋白A也是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)寄生蜱必需的膜蛋白；2）膜蛋白A與膜蛋白C的表達(dá)呈相互排斥的關(guān)系，當(dāng)膜蛋白A表達(dá)的時(shí)候膜蛋白C則不表達(dá)，反之亦然；3）缺失膜蛋白A基因的病原體雖然喪失了寄生蜱的能力，但能通過(guò)人工接種方式感染哺乳動(dòng)物，說(shuō)明膜蛋白A不是感染哺乳動(dòng)物必需的；4）膜蛋白A蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性，經(jīng)膜蛋白A免疫的小鼠對(duì)病原體具有長(zhǎng)期的免疫保護(hù)作用。特別值得一提的是膜蛋白A曾作為疫苗在美國(guó)使用了4年，但后來(lái)撤出市場(chǎng)，所以目前國(guó)際上還沒(méi)有供人類使用的萊姆病疫苗。

正是由于膜蛋白A和膜蛋白C分別是病原體寄生蟲媒蜱和哺乳動(dòng)物必需的毒力因子，所以在過(guò)去的幾十年間對(duì)它們進(jìn)行了最廣泛和深入的研究。近年，美國(guó)西南醫(yī)學(xué)中心和國(guó)立衛(wèi)生研究所的兩個(gè)課題組利用遺傳操作方法又發(fā)現(xiàn)這兩蛋白的表達(dá)是受Rrp2－RpoN－RpoS信號(hào)途徑控制。這條途徑是由一個(gè)原核二元信號(hào)系統(tǒng)和兩個(gè)選擇性轉(zhuǎn)錄因子的組成，控制著與毒力相關(guān)的膜蛋白的表達(dá)（圖1），其中Rrp2是原核二元信號(hào)系統(tǒng)的反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，RpoN和RpoS是病原體的兩個(gè)選擇性轉(zhuǎn)錄因子。如圖1所示，當(dāng)蜱刺吸哺乳動(dòng)物時(shí)，反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白R(shí)rp2被磷酸化，磷酸化的Rrp2與選擇性轉(zhuǎn)錄因子RpoN（sigma 54，σ54）、RNA 聚合酶（RNAP）一起結(jié)合于另一選擇性轉(zhuǎn)錄因子rpoS（也稱sigma 38，σ38）的啟動(dòng)子，從而激活rpoS的轉(zhuǎn)錄，而表達(dá)的RpoS直接激活像膜蛋白C這類毒力因子的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)壓制像膜蛋白A這類基因的轉(zhuǎn)錄[15－22]。該致病信號(hào)途徑和致病因子的發(fā)現(xiàn)為了解萊姆病的傳播途徑、病原體與宿主的相互關(guān)系提供非常有價(jià)值的理論基礎(chǔ)。

圖1 萊姆螺旋體的Rrp2－RpoN－RpoS致病信號(hào)途徑

2 HK1－Rrp1信號(hào)途徑

對(duì)萊姆螺旋體的基因組進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與大腸桿菌多達(dá)30多個(gè)二元信號(hào)系統(tǒng)相比，萊姆螺旋體基因組只編碼了三組二元信號(hào)系統(tǒng)，即CheA－CheY、Hk1－Rrp1和Hk2－Rrp2，這三組信號(hào)途徑負(fù)責(zé)感受外界環(huán)境變化，控制了病原體為適應(yīng)逆環(huán)境的因子表達(dá)，幫助病原菌完成其生活史。CheA－CheY主要負(fù)責(zé)病原菌的趨化作用，破壞該信號(hào)系統(tǒng)后的螺旋體喪失了運(yùn)動(dòng)能力。Hk2－Rrp2二元信號(hào)系統(tǒng)的功能則如上所述，它們直接參與了病原體侵染哺乳動(dòng)物時(shí)激活的Rrp2－RpoN－RpoS信號(hào)系統(tǒng)。至今，有關(guān)對(duì)Hk1－Rrp1二元信號(hào)系統(tǒng)的報(bào)道還非常有限，最近美國(guó)印地安納大學(xué)和康涅狄格醫(yī)療健康中心的兩個(gè)課題組的研究表明，Hk1－Rrp1二元信號(hào)系統(tǒng)在病原菌從哺乳動(dòng)物傳播到蟲媒蜱的過(guò)程中被激活（圖2），控制了一些與病原體寄生蜱中腸所需因子的表達(dá)，hk1－rrp1的刪除使病原體喪失了寄生蜱中腸的能力。為了解釋這一現(xiàn)象背后蘊(yùn)含的生理機(jī)制，他們進(jìn)一步利用基因芯片技術(shù)對(duì)其進(jìn)行了更透徹的剖析，研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)調(diào)節(jié)因子Rrp1正調(diào)控了病原體寄生蜱中腸時(shí)甘油的代謝，可以設(shè)想的是當(dāng)病原體寄生蜱中腸時(shí)，它是以甘油作為碳源維持自身代謝，所以Hk1－Rrp1的失效直接降低了病原體的存活能力。如果這個(gè)設(shè)想成立，那么hk1－rrp1的刪除是不會(huì)影響病原體對(duì)哺乳動(dòng)物的感染，因?yàn)椴溉閯?dòng)物體內(nèi)存在著其它可利用的碳源。以上的諸多設(shè)想經(jīng)縝密實(shí)驗(yàn)也逐一得到了驗(yàn)證，相關(guān)研究成果也已得到發(fā)表[23－24]。

3 選擇性轉(zhuǎn)錄因子Card

除了致病信號(hào)途徑中的RpoN和RpoS這兩個(gè)選擇性轉(zhuǎn)錄因子外，萊姆螺旋體還編碼了第3個(gè)非核心轉(zhuǎn)錄因子，即轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Card。Card的同源蛋白首先發(fā)現(xiàn)于色粘球菌（Myxococcusxanthus），它參與了色粘球菌光誘導(dǎo)的胡蘿卜素形成、饑餓誘導(dǎo)的子實(shí)體形成、營(yíng)養(yǎng)相關(guān)基因的表達(dá)等多個(gè)發(fā)育進(jìn)程[25－32]。最近，對(duì)肺結(jié)核分支桿菌（Mycobacterim Tuberculosis）Card蛋白的研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的調(diào)節(jié)核糖體RNA轉(zhuǎn)錄的機(jī)制，結(jié)核桿菌Card能夠控制核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄，從而降低蛋白翻譯速率使結(jié)核桿菌能夠長(zhǎng)期潛伏宿主，因此Card也成為了治療肺結(jié)核的潛在藥物靶標(biāo)之一[33]。對(duì)Card蛋白序列分析又發(fā)現(xiàn)，該蛋白也是報(bào)道的原核生物中唯一一類與真核生物高遷移率蛋白家族A（High－mobility group A，HMGA）轉(zhuǎn)錄因子具有相似結(jié)構(gòu)和功能的蛋白，高遷移率蛋白家族A具有結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子的功能，能與DNA小溝結(jié)合激活多種途徑的靶基因啟動(dòng)子，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)程[34]，比如多種惡性腫瘤的發(fā)生與高遷移率蛋白的表達(dá)量升高呈正相關(guān)關(guān)系。所以，Card這類蛋白無(wú)論是在原核生物還是在真核生物中都發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。

為了探索萊姆螺旋體Card的生物學(xué)功能，我們?cè)鴮?duì)其進(jìn)行了初步分析，發(fā)現(xiàn)Card在病原體模擬蜱的內(nèi)環(huán)境條件下被激活，而且其表達(dá)模式是獨(dú)立的，不受已發(fā)現(xiàn)的其它萊姆螺旋體信號(hào)途徑調(diào)控[35]，所以根據(jù)我們前期研究成果，結(jié)合已報(bào)道的Card同源蛋白的功能研究，提出了關(guān)于萊姆螺旋體Card生物學(xué)功能的一個(gè)假說(shuō)（圖2），即Card調(diào)控的基因產(chǎn)物使螺旋體在蜱體內(nèi)具有了長(zhǎng)期“休眠”的能力，此假說(shuō)的驗(yàn)證工作正在進(jìn)行中。

圖2 萊姆螺旋體跨物種傳播的致病機(jī)理假說(shuō)

4 存在問(wèn)題與展望

相對(duì)于其它蟲媒傳播疾病而言，由于萊姆螺旋體的潛在危害性、遺傳操作的可行性、動(dòng)物模型建立的簡(jiǎn)易性以及在病原菌分類學(xué)上的重要意義，現(xiàn)已成為揭露蟲媒傳播疾病致病機(jī)理的一個(gè)主要研究對(duì)象。雖然全世界科研工作者經(jīng)過(guò)幾十年的努力使有關(guān)萊姆螺旋體致病機(jī)制的信號(hào)傳導(dǎo)途徑初見(jiàn)端倪，但仍有一些基本的科學(xué)問(wèn)題有待進(jìn)一步的明確：（1）Rrp2－RpoN－RpoS致病信號(hào)途徑的Rrp2是如何被磷酸化的？我們已有的結(jié)果已清楚表明組氨酸激酶II并不是Rrp2的激活因子，而乙酰磷酸雖然可以磷酸化Rrp2，但它并不是充分必要因子，所以后續(xù)工作只有在完全鑒定了與Rrp2互作蛋白的基礎(chǔ)上，此問(wèn)題才有望解決；（2）選擇性轉(zhuǎn)錄因子RpoS具體的調(diào)控機(jī)制是什么？由于最近的研究表明鐵離子攝取蛋白能夠與RpoS的啟動(dòng)子緊密結(jié)合，敲除了鐵離子攝取蛋白基因的螺旋體喪失了表達(dá)RpoS的能力。這與現(xiàn)有的假說(shuō)即RpoS僅僅受Rrp2和RpoN直接控制是有出入的，所以有關(guān)RpoS啟動(dòng)子的研究工作有待進(jìn)一步完善；（3）Hk1－Rrp1在蜱體內(nèi)的生物學(xué)意義有待進(jìn)一步探討。甘油代謝途徑僅僅是 Hk1－Rrp1途徑控制的一個(gè)效應(yīng)因子，Microarray結(jié)果顯示了Hk1－Rrp1還控制其他一些重要的生化途徑，這些途徑有待螺旋體的遺傳操作、生化實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證；（4）除此之外，還有一些列其他重要現(xiàn)象有待解決，如病原體是如何對(duì)抗蜱媒的免疫系統(tǒng)、蜱體內(nèi)微生物間的相互作用是否對(duì)螺旋體的致病途徑產(chǎn)生影響、如何利用螺旋體自身蛋白或宿主蛋白開(kāi)發(fā)多價(jià)疫苗等，所以要真正達(dá)到蜱傳萊姆病的預(yù)防與控制的目標(biāo)丞需長(zhǎng)期的堅(jiān)持不懈的研究探索。

[1]萬(wàn)康林，張哲夫，張金聲，等.中國(guó)20個(gè)省、區(qū)、市動(dòng)物萊姆病的初步調(diào)查研究[J].中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，1998，9（5）：366－371.

[2]Grimm D，Tilly K，Byram R，et al.Outer surface protein C of the Lyme disease spirochete：aprotein induced in ticks for infection of mammals[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（9）：3142－3147.

[3]Gilmore RD，Piesman J.Inhibition ofBorreliaburgdorferimigration from the midgut to the salivary glands following feeding by ticks on OspC－immunized mice[J].Infect and Immun，2000，68（1）：411－414.

[4]Ramamoorthi N，Narasimhan S，Pal U，et al.The Lyme disease agent exploits a tick protein to infect the mammalian host[J].Nature，2005，436（7050）：573－577.

[5]Schwan TG，Piesman J，Golde WT，et al.Induction of an outer surface protein onBorreliaburgdorferiduring tick feeding[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92（7）：2909－2913.

[6]Schwan TG，Piesman J.Temporal changes in outer surface protein A and C of the Lyme disease－associated spirochete，Borrelia burgdorferi，during the chain of infection in ticks and mice[J].J Clin Microbiol，2000，38（1）：382－388.

[7]Stewart PE，Wang X，Bueschel DM，et al.Delineating the requirement for theBorreliaburgdorferivirulence factor OspC in the mammalian host[J].Infect and Immun，2006，74（6）：3547－3553.

[8]Tilly K，Krum JG，Bestor A，et al.BorreliaburgdorferiOspC protein required exclusively in a crucial early stage of mammalian infection[J].Infect and Immun，2006，74（6）：3554－3564.

[9]de Silva AM，Telford SR，Brunet LR，et al.BorreliaburgdorferiOspA is an arthropod－specific transmission－blocking Lyme disease vaccine[J].J Exp Med，1996，183（1）：271－275.

[10]Fikrig E，Barthold SW，Marcantonio N，et al.Roles of OspA，OspB，and flagellin in protective immunity to Lyme borreliosis in laboratory mice[J].Infect and Immun，1992a，60（2）：657－661.

[11]Fikrig E，Barthold SW，Kantor FS，et al.Long－term protection of mice from Lyme disease by vaccination with OspA[J].Infect and Immun，1992b，60（3）：773－777.

[12]Montgomery RR，Malawista SE，F(xiàn)een JM，et al.Direct demonstration of antigenic substitution ofBorreliaburgdorferiex vivo：exploration of the paradox of the early immune response to outer surface proteins A and C in Lyme disease[J].J Exp Med，1996，183（1）：261－269.

[13]Ohnishi J，Piesman J，de Silva AM，Antigenic and genetic heterogeneity ofBorreliaburgdorferipopulations transmitted by ticks[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（2）：670－675.

[14]Pal U，Montgomery R R，Lusitani D，et al.Inhibition ofBorreliaburgdorferi－tick interactions in vivo by outer surface protein A antibody[J].J Immunol，2001，166（12）：7398－7403.

[15]Burtnick MN，Downey JS，Brett PJ，et al.Insights into the complex regulation ofrpoSinBorreliaburgdorferi[J].Mol Micro－biol，2007，65（2）：277－293.

[16]Caimano MJ，Eggers CH，Hazlett RO，et al.RpoS is not central to the general stress response inBorreliaburgdorferibut does control expression of one or more essential virulence determinants[J].Infect and Immun，2004，72（11）：6433－6445.

[17]Caimano MJ，Iyer R，Eggers CH，et al.Analysis of the RpoS regulon inBorreliaburgdorferiin response to mammalian host signals provides insight into RpoS function during the enzootic cycle[J].Mol Microbiol，2007，65（5）：1193－1217.

[18]Fisher MA，Grimm D，Henion AK，et al.Borreliaburgdorferiσ54is required for mammalian infection and vector transmission but not for tick colonization[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（14）：5162－5167.

[19]H bner A，Yang X，Nolen DM，et al.Expression ofBorrelia burgdorferiOspC and DbpA is controlled by a RpoN－RpoS regulatory pathway[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2001，98（22）：12724－12729.

[20]Ouyang Z，Blevins JS，Norgard MV，et al.Transcriptional interplay among the regulators Rrp2，RpoN and RpoS inBorrelia burgdorferi[J].Microbiology，2008，154（Pt9）：2641－2658.

[21]Smith AH，Blevins JS，Bachlani GN，et al.Evidence that RpoS（σS）inBorreliaburgdorferiis controlled directly by RpoN（σ54／σN）[J].J Bacteriol，2007，189（5）：2139－2144.

[22]Yang XF，Alani SM，Norgard MV.The response regulator Rrp2 is essential for the expression of major membrane lipoproteins inBorreliaburgdorferi[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（19）：11001－11006.

[23]Caimano MJ，Kenedy MR，Kairu T，et al.The hybrid histidine kinase Hk1is part of a two－component system that is essential for survival ofBorreliaburgdorferiin feedingIxodesscapularisticks[J].Infect Immun，2011，79（8）：3117－3130.

[24]He M，Ouyang Z，Troxell B，et al.Cyclic di－GMP is essential for the survival of the Lyme disease spirochete in ticks[J].PLoS pathog，2011，7（6）：e1002133.

[25]Balsalobre JM，Ruiz－Vázquez RM，Murillo FJ.Light induction of gene expression inMyxococcusXanthus[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1987，84（8）：2359－2362.

[26]El as－Arnanz M，Padmanabhan S，Murillo FJ.The regulatory action of the myxobacterial CarD／CarG complex：a bacterial enhanceosome[J].FEMS Microbiol Rev，2010，34（5）：764－778.

[27]Fontes M，Galbis－Mart nez L，Murillo FJ.A novel regulatory gene fro light－induced carotenoid synthesis in the bacteriumMyxococcusxanthus[J].Mol Microbiol，1993，47（2）：561－571.

[28]Galbis－Mart nez M，F(xiàn)ontes M，Murillo FJ.The high－mobility group A－type protein CarD of the bacteriumMyxococcusXanthusas a transcription factor for several distinct vegetative genes[J].Genetics，2004，167（4）：1585－1595.

[29]Kaiser D.Myxococcus－from single－cell polarity to complex multicellular patterns[J].Annu Rev Genet，2008，42：109－130.

[30]Kroos L.TheBacillusandMyxococcusdevelopmental networks and their transcriptional regulators[J].Annu Rev Genet，2007，41：13－39.

[31]Mart nez－Laborda A，Murillo FJ.Genic and allelic interactions in the carotenogenic response ofMyxococcusxanthusto blue light[J].Genetic，1989，122（3）：481－490.

[32]Nicol s FJ，Ruiz－V zquez RM，Murillo FJ.A genetic link between light response and multicellular development in the bacteriumMyxococcusxanthus[J].Genes Dev，1994，8（19）：2375－2387.

[33]Stallings CL，Stephanou NC，Chu L，et al.CarD is an essential regulator of rRNA transcription required forMycobacteriumtuberculosispersistence[J].Cell，2009，138（1）：146－159.

[34]Nicol s FJ，Cayuela ML，Mart nez－Argudo IM，et al.High mobility group I（Y）－like DNA－binding domains on a bacterial transcrition factor[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（14）：6881－6885.

[35]Yang X F，Goldberg MS，He M，et al.Differential expression of aputative CarD－like transcriptional regulator，LtpA，inBorreliaburdorferi[J].Infect and Immun，2008，76（10）：4439－4444.