實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織石蠟切片制作中易發(fā)問(wèn)題探討

柏美玲 宋昱 林群凡 鄧爽 胡少青 伍義行

石蠟切片是組織病理學(xué)制片技術(shù)中最為常用的方法，廣泛應(yīng)用于臨床診斷和科研教學(xué)中。石蠟切片制作涉及取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、封片等系列步驟，影響因素眾多，且不同組織類型具有不同的特點(diǎn)，每個(gè)操作環(huán)節(jié)的失誤都將影響切片的最終質(zhì)量［1］。肝組織具有細(xì)胞成分較多、細(xì)胞間隙較大、纖維結(jié)締組織較少、質(zhì)地較脆等特點(diǎn)，肝組織蠟塊在切片時(shí)易碎裂，染色后常呈脫水和透明過(guò)度的表現(xiàn)(如出現(xiàn)大量裂紋等)，從而影響肝組織原始形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察和結(jié)果的判斷。而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝組織石蠟切片在肝病研究、抗肝炎藥物藥效評(píng)價(jià)、新藥毒理學(xué)評(píng)價(jià)和組織病理教學(xué)中起到了十分重要的作用。因此，本文結(jié)合自己的研究經(jīng)驗(yàn)，重點(diǎn)對(duì)常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(大、小鼠)肝組織石蠟切片制作的特點(diǎn)和常見(jiàn)問(wèn)題進(jìn)行了分析總結(jié)，并提出了相應(yīng)的解決方法。

1 取材

取材組織面積一般為1.5 cm×1.5 cm，厚度不超過(guò)0.3 cm，組織太大或過(guò)厚時(shí)均可降低脫水效果。取大小鼠肝組織時(shí)，應(yīng)先進(jìn)行放血處理，再解剖取肝組織，以防止肝組織內(nèi)積血，影響切片效果。因肝組織屬于脆弱器官，應(yīng)小心使用鑷子的彎月面移動(dòng)或夾取器官，防止鑷子尖端損傷肝組織造成人為破壞。

2 固定

固定的目的在于保存組織內(nèi)細(xì)胞原有的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。石蠟切片常用固定液有甲醛、乙醇、醋酸、AF液(乙醇+甲醛液)、AAF液(醋酸+乙醇+甲醛液)等，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)材料的性質(zhì)及制片目的不同，選用適宜的固定液［2］。肝組織切片制作常選擇福爾馬林作為固定液，因其對(duì)肝組織具有較強(qiáng)的穿透力，可有效抑制溶酶體酶對(duì)肝組織的自溶和細(xì)菌的繁殖，保護(hù)正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)。切取標(biāo)本后應(yīng)盡快將標(biāo)本置于盛有足夠固定液的容器內(nèi)固定，以確保細(xì)胞形態(tài)上的原始性，防止組織死后自溶而產(chǎn)生變化［3］。固定液應(yīng)以新配為好，選用福爾馬林固定肝組織時(shí)間應(yīng)不少于4 h，不大于48 h。此外，也可采用微波處理法固定組織［4］。

3 脫水

脫水的目的是采用脫水劑將組織內(nèi)的水份置換出來(lái)，以利于有機(jī)溶劑的滲入。常用脫水劑是酒精，而正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧六環(huán)等也可做脫水劑。動(dòng)物肝組織常選用乙醇作為脫水劑，其優(yōu)點(diǎn)是比較溫和，對(duì)組織傷害比較小。肝組織也可選用正丁醇脫水，其優(yōu)點(diǎn)是可省去二甲苯透明直接浸蠟而縮短制作時(shí)間，且不會(huì)引起組織塊過(guò)度收縮，但易出現(xiàn)脫水不足的現(xiàn)象［5］。另外將正丁醇與乙醇按比例混合后作脫水劑效果也較好。脫水劑使用一段時(shí)間后，試劑揮發(fā)或者混雜其它雜質(zhì)會(huì)引起濃度降低，均影響組織脫水效果［6］。因此，脫水劑要定期更換，更換時(shí)最好用比重計(jì)測(cè)量各級(jí)酒精的濃度［7］。此外，還應(yīng)注意:①脫水應(yīng)逐步進(jìn)行，順序顛倒會(huì)極大影響脫水效果;②在無(wú)水乙醇中不得放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)引起組織塊過(guò)度硬化，導(dǎo)致切片時(shí)組織破碎;③更換脫水劑時(shí)，浸泡時(shí)間需減去吸水過(guò)程中所耽誤的時(shí)間，以免脫水不足;④脫水必須在有蓋的玻璃瓶中進(jìn)行，防止吸收空氣中的水分和酒精揮發(fā)，保證脫水徹底。

4 透明

透明劑可替換出組織內(nèi)的乙醇，使石蠟順利地滲入組織中，增強(qiáng)組織的折光系數(shù)從而出現(xiàn)透明狀態(tài)。常用的透明劑有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇、香柏油等。動(dòng)物肝組織常選用二甲苯作透明劑，因二甲苯對(duì)神經(jīng)的麻醉作用及粘膜的刺激性，使用時(shí)應(yīng)盡量在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，也可用硬脂酸石蠟混合液代替二甲苯透明［8］。由于二甲苯對(duì)組織的收縮性強(qiáng)，作用迅速，故組織在二甲苯中時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則組織容易變脆變硬。透明劑的浸漬時(shí)間要根據(jù)組織材料塊大小及性質(zhì)而定。如果透明時(shí)間過(guò)短，則透明不徹底，石蠟難于浸入組織;透明時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，則組織硬化變脆，不易切出完整切片。動(dòng)物肝組織若選用二甲苯為透明劑，可分為三階段(二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅲ10 min)進(jìn)行。二甲苯應(yīng)定期更換，以免揮發(fā)或吸濕造成濃度改變，影響透明的程度。此外，如果透明時(shí)組織周圍出現(xiàn)白色霧狀，說(shuō)明材料中的水份未被脫凈，應(yīng)退回重新脫水后再透明。

5 包埋

包埋是標(biāo)本經(jīng)脫水后浸入包埋劑，并使之滲透進(jìn)入標(biāo)本本體的過(guò)程。石蠟是常用的包埋劑，包埋用石蠟應(yīng)與浸蠟用石蠟熔點(diǎn)一致，并且與樣品硬度相近。透蠟溫度要恒定，模具、樣品和石蠟之間溫差要一致，以保障石蠟充分包圍并支撐樣品。為了防止組織未包埋完就已凝固，故包埋溫度要略高，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致組織收縮變硬變脆，不利于切片［9］。此外，新購(gòu)臘塊可經(jīng)多次反復(fù)加熱，使其包含的氣體蒸發(fā)。在包埋之前可用高溫將石蠟融化，再降低至需要的溫度，溫度一般比石蠟熔點(diǎn)高5℃ ～6℃即可。動(dòng)物肝組織包埋溫度為62℃時(shí)效果較好。包埋操作要迅速，力求在最短時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過(guò)程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等［10］。浸蠟時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則易造成組織塊脆硬，切片如豆腐渣樣。包埋后石蠟的迅速冷卻，可防止包埋塊中產(chǎn)生結(jié)晶以致切片碎裂等現(xiàn)象發(fā)生［11］。

6 染色

標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后切成4～5 μm厚的薄片，再經(jīng)脫蠟后進(jìn)行染色。蘇木素-伊紅染色法是石蠟切片常用的染色法之一，伊紅作為對(duì)比染色劑不應(yīng)染得太紅，以免細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)難以區(qū)分，故染色時(shí)間不能太長(zhǎng);但也不能染得太淡，否則細(xì)胞質(zhì)著色不完全，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核紅藍(lán)對(duì)比不明顯，故染色時(shí)間也不能太短［12］。此外，染色還需注意:①加溫染色時(shí)溫度不應(yīng)太高，過(guò)高則會(huì)使物理染色性增強(qiáng)，肝組織選擇50℃、染色5 min效果較好;②染色試劑應(yīng)及時(shí)更換，避免有效成分減少;③分化時(shí)操作應(yīng)在鏡下控制核的染色，防止分化液不起作用;④染色過(guò)程中所用乙醇、二甲苯等試劑常有染色劑混入影響染色效果，應(yīng)定期更換避免染色劑的污染。染色結(jié)束進(jìn)行封片，封片時(shí)中性樹膠滴加要適量，太少或過(guò)稀時(shí)均易出現(xiàn)空泡。封片后即可保存或在顯微鏡下觀察。綜上所述，組織切片質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響結(jié)果的判斷，而制作高質(zhì)量的切片需要長(zhǎng)期的摸索和改進(jìn)。由于肝組織固有的特點(diǎn)，肝組織蠟塊在切片時(shí)較脆易碎，染色后鏡下結(jié)構(gòu)常呈現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，影響了肝組織原始結(jié)構(gòu)的觀察。因此，不斷地分析總結(jié)肝組織石蠟切片制作的特點(diǎn)，探索肝組織制片的新技術(shù)和新方法，提高肝組織切片制作水平，對(duì)教學(xué)科研和臨床診斷工作具有重要意義。

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