BCL-G的研究進(jìn)展和意義

蔣朋飛 張德禮 (西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)免疫學(xué)研究所農(nóng)業(yè)部動物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室病毒免疫與生物信息研究室、生物信息學(xué)研究中心分子病毒免疫與腫瘤系統(tǒng)生物學(xué)研究組，楊凌712100)

細(xì)胞凋亡(Apoptosis)也稱為“程序性細(xì)胞死亡”或“細(xì)胞自殺”，是由基因介導(dǎo)的一系列變化，是存在于所有哺乳動物細(xì)胞中的保守途徑。細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)生物體正常發(fā)育和生命活動的一種不可缺少的機(jī)制，該調(diào)節(jié)一旦失敗，可能導(dǎo)致機(jī)體疾病、畸形甚至死亡。對免疫系統(tǒng)而言，細(xì)胞凋亡不僅是免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中必不可少的一個環(huán)節(jié)，而且是免疫系統(tǒng)行使功能的一種方式。細(xì)胞凋亡的發(fā)生和調(diào)控涉及到多個基因家族，其中BCL-2基因家族就是一個與凋亡密切相關(guān)的基因家族，該家族成員對細(xì)胞凋亡與否起關(guān)鍵作用。BCL-G也稱作BCL-2-like14，是近來在人類、小鼠、豬、牛等物種中發(fā)現(xiàn)的BCL-2家族的促凋亡成員之一，研究證明該基因?yàn)榇偌?xì)胞凋亡因子，其存在三種可變剪接體，蛋白產(chǎn)物能夠與 BCL-XL、p53、PARbZIP、TEF、JAB1、MELK、MNSFβ、ERK等蛋白相互作用，與癌癥、化療引起的細(xì)胞凋亡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及先天性心臟病等密切相關(guān)。因此，該基因具體作用機(jī)制的研究對于癌癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和先天性心臟病等疾病的治療具有重要的指導(dǎo)意義。

1 BCL-G基因的基本特點(diǎn)

BCL-G是2001年Guo等人發(fā)現(xiàn)的人類BCL-2家族的新成員，定位于人類染色體12p12。最初研究表明，BCL-G基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能發(fā)生可變性剪接，編碼兩種蛋白質(zhì)，分子量較大的為BCL-GL，較小的為BCL-Gs，分別含有327和252個氨基酸。兩種蛋白的前226個氨基酸是相同的，之后的氨基酸序列發(fā)生分歧。BCL-GL包含BCL-2家族的BH2和BH3兩種結(jié)構(gòu)域，BCL-GS僅包含BH3一種結(jié)構(gòu)域。在組織特異性方面，BCL-GL主要表達(dá)于睪丸組織，但在包括前列腺、胰腺、骨髓以及脾臟等人體組織中也有表達(dá)，而BCL-Gs僅表達(dá)于成年人的睪丸組織［1］。后來的研究發(fā)現(xiàn)，BCL-G還存在另外一種可變剪接體BCL-GM，編碼的蛋白質(zhì)含有276個氨基酸，也缺少BH2結(jié)構(gòu)域。而且，BCL-GM也只表達(dá)于睪丸組織［2］。研究發(fā)現(xiàn)，在刀豆素A刺激的D.10G4.1細(xì)胞中BCL-G能被單克隆非特異性抑制因子β蛋白(MNSFβ)共價結(jié)合并修飾［3］。后來又發(fā)現(xiàn)，在未刺激的Raw264.7細(xì)胞系中，MNSFβ也能夠與BCL-G共價結(jié)合形成復(fù)合體，BCL-G在其中起到穩(wěn)定MNSFβ的作用，該復(fù)合體能夠與ERK的磷酸化位點(diǎn)附近結(jié)合并抑制其活性［4］。因此，在不同的細(xì)胞中，BCL-G被MNSFβ修飾的機(jī)制是不同的。Reed等的專利稱BCL-G的多肽和核酸可以用來治療癌癥等疾病。然而，最近的研究表明，BCL-G的BH3結(jié)構(gòu)域并沒有發(fā)生突變而參與抵抗喉鱗癌的機(jī)制［5］。因此，其抵抗癌癥的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。另外，最新的研究表明BCL-G是轉(zhuǎn)錄因子Pax-8的下游基因，可能在先天性心臟病間隔缺損的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［6］。

2 BCL-GS的結(jié)構(gòu)和功能

2.1 BCL-GS的BH3結(jié)構(gòu)域與定位 BCL-2家族只含有BH3結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，如果被去除BH3結(jié)構(gòu)域，能阻止其與BCL-2家族的抗凋亡蛋白相互作用，而且能影響其與線粒體的相互關(guān)聯(lián)。盡管只含有BH3結(jié)構(gòu)域的BCL-GS蛋白沒有疏水的結(jié)構(gòu)域?qū)⑵溴^定到膜上，但是它仍然能持續(xù)性與胞內(nèi)細(xì)胞器相互作用。而且，值得注意的是，BH3結(jié)構(gòu)域的去除并不能干擾BCL-GS的細(xì)胞器定位，但是能阻止其與BCL-XL形成二聚體，從而不被抗凋亡蛋白BCL-XL所抑制，由此斷定，BCL-GS與胞內(nèi)細(xì)胞器的關(guān)系和BH3結(jié)構(gòu)域毫無關(guān)系，其定位機(jī)制還需要深入研究才能確定［1］。

2.2 BCL-GS基因是促凋亡蛋白p53的靶基因

p53是一種能引起細(xì)胞凋亡的蛋白，具體的機(jī)制尚不清楚。在被p53調(diào)控的促凋亡基因中，很多是BCL-2家族的成員。全基因組p53結(jié)合位點(diǎn)圖譜的繪制表明，相對于抗凋亡基因來說，p53的結(jié)合位點(diǎn)更接近于編碼促凋亡BCL-2家族蛋白的基因。p53被證明是包括 Bax、Puma和 Noxa等在內(nèi)的許多BCL-2家族基因表達(dá)的調(diào)控因子［7，8］。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，在BCL-GS基因的第一個內(nèi)含子中含有p53結(jié)合位點(diǎn)，所以它很有可能也是p53調(diào)控的靶位點(diǎn)。在p53-Soas-2細(xì)胞中，根據(jù)四環(huán)素誘導(dǎo)的p53等位基因的激活情況，BCL-GS的mRNA水平被上調(diào)。運(yùn)用RNAi技術(shù)抑制BCL-GS的表達(dá)，能明顯但不能完全終止p53導(dǎo)致的細(xì)胞死亡［9］。這都表明，p53結(jié)合位點(diǎn)的存在足以識別BCL-G作為p53的靶基因。p53可以調(diào)節(jié)多個只含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，以行使其凋亡作用，而 BCL-GS是染色體12p12上的一個腫瘤抑制因子［2］，因此，BCL-GS很可能參與了 p53調(diào)控的腫瘤抑制途徑。

2.3BCL-GS基因與TEF、DBP等蛋白的相互作用BCL-GS基因啟動子區(qū)域存在促甲狀腺激素胚胎因子(Thyrotroph embryonic factor，TEF)和D位點(diǎn)結(jié)合蛋白(D-site-binding protein，DBP)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，二者都能不同程度地促進(jìn) BCL-GS的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［10］。在COS-7細(xì)胞中過量表達(dá)BCL-GS能夠引起細(xì)胞凋亡，這種現(xiàn)象能夠被BCL-XL蛋白的過量表達(dá)所抑制［1］。然而，在過表達(dá) TEF的 HCT116和NTERA2細(xì)胞中，雖然BCL-GS的mRNA水平上升，但是卻不能引起細(xì)胞凋亡。這可能是由于COS-7細(xì)胞中內(nèi)源的BCL-GS蛋白含量高于HCT116和NTERA2細(xì)胞，也有可能是兩類細(xì)胞中抗凋亡蛋白BCL-2或BCL-XL的量決定了細(xì)胞的命運(yùn)，因?yàn)檫@兩種蛋白都能夠結(jié)合僅含有BH3結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員，使其喪失促凋亡功能［11-13］。另外，在小鼠的肝臟中還發(fā)現(xiàn)了一種D位點(diǎn)結(jié)合蛋白的可變剪接體tDBP，它保留了DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但丟失了轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。研究表明，tDBP能與TEF競爭性地和BCL-GS的啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制TEF介導(dǎo)的內(nèi)源性BCL-GS的增加。TEF-BCL-GS途徑可能參與了控制應(yīng)答于化療制劑的凋亡的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，具體的參與機(jī)制有待進(jìn)一步研究［11］。

2.4JAB1與BCL-GS相互作用加速了線粒體途徑的細(xì)胞凋亡 Jun激活區(qū)域-連接蛋白1(c-Jun activation domain-binding protein1，JAB1)是一種蛋白復(fù)合體，其能與許多蛋白相互作用，并能行使不同的細(xì)胞功能。研究表明，JAB1能特異性的與BCL-GS相互作用，而且BCL-GS的N-末端的1～67個氨基酸和JAB1的MPN結(jié)構(gòu)域是相互作用所必需的，這是目前唯一的對BCL-GSN-末端作用的報道。重要的是，BCL-GS和JAB1的協(xié)同作用能引起凋亡。JAB1能與BCL-XL/BCL-2競爭性地結(jié)合BCL-GS，從而促進(jìn)凋亡。用RNAi技術(shù)降低JAB1的表達(dá)水平能減弱BCL-GS誘導(dǎo)的凋亡，這表明JAB1在BCL-GS行使功能過程中所起的關(guān)鍵作用。BCL-GS和JAB1在促進(jìn)凋亡中的可能作用機(jī)制如圖1所示。在正常健康細(xì)胞中，BCL-GS通過其 BH3結(jié)構(gòu)域與 BCL-2/BCL-XL相互作用，維持了細(xì)胞的平衡。當(dāng)BCL-GS或JAB1表達(dá)上調(diào)時，它們能在細(xì)胞質(zhì)中相互作用，并減弱BCL-GS-BCL-2的結(jié)合親和性。BCL-GS的過表達(dá)或者BCL-GS與JAB1的結(jié)合都能導(dǎo)致Bax表達(dá)上調(diào)并由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)定位到線粒體，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，caspase的活化和細(xì)胞凋亡的發(fā)生［14］。

3 BCL-GL的結(jié)構(gòu)和功能

圖1 BCL-GS與JAB1促細(xì)胞凋亡作用機(jī)制模型［14］Fig．1 Models for BCL-GSfunction in regulation of apoptosis and role of JAB1［14］

3.1BCL-GL結(jié)構(gòu)的特殊性與功能的關(guān)系 BCL-2家族的蛋白大致分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩類，其中抗凋亡的 BCL-2、BCL-XL、MCL-1和 BCL-w等蛋白都含有BH1～BH4中的三到四個結(jié)構(gòu)域。而與其功能相反的促凋亡蛋白可以分為兩個亞類，一類為只含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白，包括Bik、Bad、Hrk/DP5、Bid、Bim/Bod、Noxa、Puma、Bmf 和 BCL-Gs等［15］;另一類為 Bax 家族，包括 Bax、Bak 和 Bok/Mtd等，它們含有BH1～BH3三種結(jié)構(gòu)域［16］。研究表明，只含有BH3的蛋白主要參與凋亡的起始，而Bax等蛋白主要在其信號通路的下游起作用［17，18］。BCL-2家族除了以上三類蛋白，還包括另外一類結(jié)構(gòu)特殊的蛋白，包含BCL-GL和Bfk。它們也能微弱地促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但與其它促凋亡的BCL-2家族的蛋白不同，它們只包含BH2和BH3兩種BCL-2家族的保守結(jié)構(gòu)域。而且，這兩個蛋白都不能和BCL-2家族的其它蛋白相互作用［1，19］。二者的功能可能依賴于截斷作用。BCL-GL和Bfk中的BH2和BH3結(jié)構(gòu)域的位置與Bax和BCL-2相比高度保守。而且，盡管這兩個蛋白沒有真正的BH1結(jié)構(gòu)域，它們?nèi)匀缓性S多高度保守的BH1結(jié)構(gòu)域的殘基。鑒于BCL-2和Bax結(jié)構(gòu)的相似性，BCL-GL和Bfk中BH2和BH3結(jié)構(gòu)域的位置保守性使得它們的結(jié)構(gòu)也類似于BCL-2和Bax。因此，它們的促細(xì)胞凋亡功能可能更類似于Bax和Bak，而不是只含有BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白［20］。

BCL-X基因能編碼兩種蛋白BCL-XL和BCLXs，其分別具有抗凋亡和促凋亡作用。與此不同的是，BCL-GL并沒有抗凋亡功能，當(dāng)其在細(xì)胞中被過表達(dá)時，能引起輕微而不穩(wěn)定的凋亡［1］。這種特點(diǎn)與Bim基因編碼的蛋白相類似，該基因能編碼三種蛋白，分別為較短的BimS、較長的BimL和超長的BimEL

［21］。BimL和BimEL能與微管相關(guān)的動力蛋白的輕鏈(DLC)形成復(fù)合體，這樣就能阻止它們與靶蛋白相互作用，這與BCL-XL在線粒體或其它細(xì)胞器的表面相似［22］。與此相反，BimS不能與DLC相互作用，所以它能自由地與BCL-2、BCL-XL及其它抗凋亡蛋白相互作用，因此，當(dāng)其在細(xì)胞中過表達(dá)時能發(fā)揮促凋亡功能。與此類似，由于BCL-GS能夠與BCL-2及BCL-XL等相互作用，而BCL-GL卻不能，因此BCL-GL很可能也與某種未知螯合蛋白形成復(fù)合體［1］。

3.2 BCL-GL的翻譯后修飾 BCL-2家族蛋白的促凋亡功能能夠被翻譯后修飾所抑制，其中一種翻譯后修飾是磷酸化。例如，Bad蛋白就能被磷酸化失活。這種蛋白可以被包括PKA、PKB、Raf1和Pak1在內(nèi)的多種蛋白激酶直接或間接磷酸化，這樣就能阻止其與靶蛋白 BCL-2和 BCL-XL形成二聚體［23，24］。Bad在細(xì)胞中的定位因其磷酸化的狀態(tài)不同而異，磷酸化的Bad蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)，未磷酸化的Bad與線粒體或其它胞內(nèi)細(xì)胞器相關(guān)聯(lián)，而這些細(xì)胞器也正是BCL-2和BCL-XL定位的地方。在這方面，BCL-GL蛋白含有PKA和PKC的磷酸化作用位點(diǎn)，然而至今還沒有發(fā)現(xiàn)這兩種激酶對BCL-GL的磷酸化。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌和許多細(xì)胞系中都表達(dá)很高水平的母源胚胎亮氨酸拉鏈激酶(MELK)通過其N-末端與BCL-GL相互作用。BCLGL在體外能被MELK特異磷酸化，野生型MELK的過表達(dá)能夠抑制BCL-GL的促凋亡功能。MELK的激酶功能可能通過抑制BCL-GL的促凋亡功能而影響哺乳動物的癌癥發(fā)生［25］。

另外一種BCL-2家族的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)水解，這能激活BCL-2家族蛋白的潛在促凋亡作用。特別是，Bid蛋白包含一個約58個氨基酸的N-末端結(jié)構(gòu)域，它能夠掩飾該蛋白的BH3結(jié)構(gòu)域，降低其與其它BCL-2家族蛋白形成二聚體的能力。然而，在被caspase切割的時候，N-末端的切除能暴露出BH3結(jié)構(gòu)域，與Bid從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)定位到線粒體有關(guān)，在這里引起細(xì)胞色素 c的釋放和細(xì)胞凋亡［26，27］。雖然 BCL-GL包含 caspase 的識別位點(diǎn)，但是還沒有在體外用純化的有活性的caspase或在細(xì)胞凋亡過程中，證明BCL-GL蛋白發(fā)生了重要的切割。但是，也不能排除有未發(fā)現(xiàn)的特定的caspase能切割激活BCL-GL［1］，這有待于研究。

3.3 BCL-GL與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病密切相關(guān)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種普遍的自體免疫病?；加蠸LE的病人免疫調(diào)節(jié)顯著缺陷，能夠?qū)?xì)胞內(nèi)大部分因子產(chǎn)生抵抗反應(yīng)。CD4+T淋巴細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)者，在SLE發(fā)病機(jī)理中起著重要作用。許多研究確證，在SLE病人中，伴隨著CD4+T細(xì)胞急劇減少的T細(xì)胞淋巴瘤是普遍的，并且許多特異性缺陷能夠完全改變其信號通路，從而改變其表型和功能。細(xì)胞凋亡作為一種必需的細(xì)胞清除過程在CD4+T淋巴細(xì)胞的外周免疫耐受的建立中起關(guān)鍵作用，并能夠調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的功能。不平衡的細(xì)胞凋亡被確認(rèn)為SLE免疫缺陷的主要部分，BCL-GL基因在SLE病人的外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中的表達(dá)顯著較高［28，29］。而且，這種疾病特異性的 BCL-GL上調(diào)只發(fā)生在SLE病人的CD4+T淋巴細(xì)胞中，這表明，BCL-GL表達(dá)可能在SLE的CD4+T淋巴細(xì)胞的異常凋亡中起重要作用［29］。值得注意的是，BCL-GL被發(fā)現(xiàn)是一種IFN誘導(dǎo)蛋白(IFIGs)，其能通過激活轉(zhuǎn)錄下游的促凋亡p53蛋白而被IFN-α和IFN-γ上調(diào)［8，29］。很多關(guān)于 SLE病人外周血細(xì)胞的基因表達(dá)的資料都一致表明IFIGs的上調(diào)可能導(dǎo)致了SLE的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，通過重組慢病毒的BCL-GL的過表達(dá)，能夠促進(jìn)原代人CD4+T淋巴細(xì)胞的凋亡，這表明BCL-GL的翻譯后修飾能夠影響T細(xì)胞的凋亡和存活。而且，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，BCL-GL的表達(dá)上調(diào)與外周T細(xì)胞的凋亡增加成正相關(guān)。這表明，BCL-GL的表達(dá)上調(diào)可能導(dǎo)致了淋巴細(xì)胞凋亡的增加［29］。

許多研究小組都發(fā)現(xiàn)了SLE血清對淋巴細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用，并且闡明這依賴于內(nèi)源性途徑介導(dǎo)的經(jīng)典caspase活化而不是依賴于死亡受體途徑。Luo等人首次發(fā)現(xiàn)SLE血清能夠特異性上調(diào)CD4+T細(xì)胞中BCL-GL的表達(dá)，同時Fas和BCL-2的表達(dá)不受影響，并且，BCL-GL表達(dá)量的增加與CD4+T細(xì)胞的凋亡隨著時間的增長成正相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明，BCL-GL的非正常表達(dá)可能參與了SLE血清誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞的內(nèi)源性凋亡信號途徑。當(dāng)BCLGL表達(dá)量被逆病毒表達(dá)的siRNA下調(diào)時，SLE血清對CD4+T細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用會部分被減弱，這為在SLE的紊亂的CD4+T細(xì)胞凋亡中BCL-GL非正常表達(dá)的重要作用給出了更多的證據(jù)。另外，由于IFN-α 對 BCL-GL表達(dá)的影響，Luo等人［29］檢測了SLE血清中IFN-α的水平，發(fā)現(xiàn)與其它血清相比，它隨著BCL-GL表達(dá)的增加而增加，但是，BCL-GL表達(dá)量的增加只能部分地被IFN-α的封閉而抑制。這表明非正常的BCL-GL表達(dá)可能是一種復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果，受到除了IFN-α外的SLE血清中各種激活成分的調(diào)控。為了更好地了解SLE的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)BCL-GL新的非正常促凋亡信號途徑是非常重要的。

4 小結(jié)

從目前研究來看，BCL-G的作用非常廣泛和重要，其各種可變剪接體所編碼的蛋白質(zhì)具有不同的結(jié)構(gòu)，因此也有不同的功能。它們能夠與促凋亡蛋白，促轉(zhuǎn)錄蛋白等形成復(fù)合體，不同程度的促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并且能夠進(jìn)行翻譯后修飾，與癌癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和先天性心臟病的發(fā)生密切相關(guān)。BCL-G的多種功能仍有待進(jìn)一步研究并加以應(yīng)用。BCL-G的核酸和蛋白能夠用于促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對于治療癌癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和先天性心臟病等有重要的指導(dǎo)意義。對于有特殊結(jié)構(gòu)的BCL-G的功能研究可以為BCL-2家族的其他基因的研究提供借鑒。

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