空腸彎曲菌pcDNA3.1(-)-peb1A殼聚糖佐劑疫苗對小鼠免疫原性和保護性研究①

徐崗村 杜聯(lián)峰 孫萬邦 王宜峰 王勝香 羅軍敏 姚新生 夏 嬙 楊 瑞 余 妍

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)/貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，珠海519041)

空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni，CJ)為一類微需氧嗜熱革蘭陰性桿菌，是人及動物消化道共同易感菌［1］。目前，CJ感染已成為全球范圍內(nèi)急性胃腸炎最常見的病因之一［2］。CJ感染后，臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，但主要癥狀為腹瀉性腸炎，嚴重的并發(fā)癥為格林-巴利綜合征(Guillain-Barré syndrome，GBS)［3，4］。由于目前對CJ的遺傳學(xué)特性、毒力因子、致病作用與CJ誘發(fā)GBS的詳細機理尚未完全明了，至今仍缺少有效而可行的措施來防止CJ感染后格林-巴利綜合征的發(fā)生。因此，研制CJ特異性疫苗用以預(yù)防CJ感染及其相關(guān)疾病，已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點?；蛞呙缇哂锌烧T發(fā)較全面的免疫應(yīng)答、能制備抗多種病原體的多價疫苗、兼有預(yù)防和治療作用，且制備簡單、成本較低、熱穩(wěn)定性好、容易儲存運輸?shù)葍?yōu)點［5，6］。本實驗采用空腸彎曲菌 DNA 疫苗pcDNA3.1(-)-peb1A結(jié)合殼聚糖對DNA的緩釋作用和保護作用，以殼聚糖為佐劑制備空腸彎曲菌DNA佐劑疫苗，研究空腸彎曲菌DNA疫苗的免疫原性和保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 質(zhì)粒pcDNA3.1(-)，含有氨芐青霉素(Amp)和潮霉素(Hygromysin)抗性，全長5.4 kb，為Invitrogen公司產(chǎn)品。重組質(zhì)粒 pcDNA3.1(-)-peb1A為前期構(gòu)建。殼聚糖購自Sigma。HRP標記的羊抗鼠IgG、IgM購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。小鼠淋巴細胞分離液購自天津美德太平洋科技有限公司。小鼠 CD20、CD21單抗、羊抗鼠 IgGHRP、(FITC)mouse anti-rat IgG(H+L)均采購于美國eBioscience?？漳c彎曲菌(編號：ATCC700819)標準株為全基因組測序菌株，血清型Pen2，購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2實驗動物 昆明鼠240只，每劑量組30只，雄性，6～8周齡，20～25 g/只，購于遵義醫(yī)學(xué)院動物實驗中心。

1.3免疫原的制備 ①pcDNA3.1(-)-peb1A免疫原(以下簡稱裸DNA組)：根據(jù)質(zhì)粒抽提濃度適當稀釋成工作濃度。②殼聚糖-pcDNA3.1(-)-peb1A免疫原(以下簡稱佐劑DNA組)：稱取殼聚糖200 mg，將之溶解于1%乙酸溶液中，濃度為0.2%(W/V，pH5.5)，充分攪拌，至澄清為止，滅菌備用。pcDNA3.1(-)-peb1A溶解于滅菌10%Na2SO4溶液中，濃度為25 μg/ml。取0.2%殼聚糖溶液500 μl與等體積pcDNA3.1(-)-peb1A混合，在旋渦混合器上混合1小時，以12 000 r/min、4℃離心30分鐘，沉淀以PBS重懸，即為殼聚糖-pcDNA3.1(-)-peb1A微?；鞈乙?。③pcDNA3.1(-)免疫原(以下簡稱空載體組)：根據(jù)質(zhì)粒抽提濃度適當稀釋成工作濃度。

1.4免疫方法 免疫接種前觀察昆明小鼠生活狀態(tài)5天，生活狀態(tài)正常，免疫前2天于注射處先注射0.25%利多卡因50 μl/腿，免疫時于小鼠股四頭肌一點注射，每只小鼠免疫原100 μl。根據(jù)本室前期對免疫接種程序的研究結(jié)果，選擇短程免疫，疫苗組設(shè)裸DNA組和殼聚糖佐劑DNA組，每組分別設(shè)3個劑量組，免疫分組見表1。

于每次免疫后第10天采集各組小鼠血清，并分離各組小鼠脾淋巴細胞包被細胞培養(yǎng)板。以間接ELISA法檢測血清中 IgM、IgG的含量。以細胞ELISA法檢測優(yōu)選組小鼠脾淋巴細胞CD20、CD21表達水平。

1.5空腸彎曲菌攻擊實驗及腸道分泌液細菌培養(yǎng)

加強免疫后4周，每組各取5只昆明小鼠分別以新鮮培養(yǎng)的1×109CJ菌液灌胃攻擊免疫后小鼠，一周后根據(jù)發(fā)病及死亡情況計算每組實驗動物的疾病指數(shù)，計算公式［疾病指數(shù)=(生病只數(shù)×1+死亡只數(shù)×2)］計算一周的平均值。根據(jù)公式［疫苗有效性=(對照組-實驗組)/對照組×100%］計算疫苗有效性，并以健康小鼠所占比例計算免疫效能。同時，攻毒后1周脫頸處死小鼠，無菌條件下取小腸液接種于空腸彎曲菌選擇培養(yǎng)基上，42℃微需氧條件下培養(yǎng)72小時，觀察菌落生長情況(無菌落生長為-，少量菌落生長為+，大量菌落生長為++)，并計算細菌指數(shù)(細菌指數(shù)=無菌生長數(shù)×0+少量菌落生長×1+大量菌落生長×2)，以無菌生長數(shù)所占比例計算免疫效能。

表1 CJ pcDNA3.1(-)-peb1A免疫分組(n=30)Tab.1 CJ pcDNA3.1(-)-peb1A immune groups(n=30)

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析，比較若方差齊用LSD檢驗，若不齊用Dun-nett檢驗。P＜0.05有顯著性差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義;P＞0.05無顯著性差異，無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DNA疫苗接種后一般情況觀察結(jié)果 實驗動物免疫接種后，各免疫組動物精神狀況良好，進食、大便情況正常，體重較免疫前稍有增加，皮毛光滑，局部注射部位無硬結(jié)、潰爛、出血，未見死亡。

2.2血清特異性抗體檢測結(jié)果

2.2.1免疫后小鼠血清IgG抗體水平變化 小鼠血清IgG水平檢測，結(jié)果顯示(見表2)：①裸DNA組和佐劑DNA組各劑量組IgG水平與兩對照組比較明顯增高(P＜0.05)，兩對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。②裸DNA組和佐劑DNA組均以100 μg劑量 IgG 水平最高(P＜0.05)，50 μg與200 μg劑量組無明顯差別(P＞0.05)。③佐劑DNA組100 μg劑量IgG抗體水平高于裸DNA組100 μg劑量(P＜0.05)。④兩實驗組小鼠血清IgG水平，第20天比第10天高，第30天又有所下降，但維持在較高水平狀態(tài)。

2.2.2血清抗體IgM水平變化 小鼠血清IgM水平檢測，結(jié)果顯示(見表3)：①裸 DNA組和佐劑DNA組IgM水平與兩對照組比較，第10天明顯增高，有顯著性差異(P＜0.05)。②佐劑DNA組以100 μg劑量 IgM水平最高(P＜0.05)。③佐劑DNA組100 μg劑量比裸DNA組100 μg劑量水平高(P＜0.05)。④兩實驗組小鼠血清IgM水平，第20、30天與第10天比較，逐漸降低。

表2 CJ pcDNA3.1(-)-peb1A免疫小鼠后血清IgG抗體OD值測定結(jié)果Tab.2 OD values of the serum IgG antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3.1(-)-peb1A

表3 CJ pcDNA3.1(-)-peb1A疫苗免疫小鼠后血清IgM抗體OD值測定結(jié)果Tab.3 OD values of the serum IgM antibody levels in mice after immunized with CJ pcDNA3.1(-)-peb1A

2.3小鼠脾淋巴細胞膜表面分子CD20和CD21水平變化

2.3.1小鼠脾淋巴細胞膜表面分子CD20水平變化 細胞ELISA法檢測免疫后小鼠脾淋巴細胞膜表面分子CD20的表達水平，結(jié)果顯示(見表4)：①裸DNA組和佐劑DNA組高于兩對照組，有顯著性差異(P＜0.05)。②佐劑DNA組高于裸DNA組，有顯著性差異(P＜0.05)。③兩實驗組小鼠血清CD20水平，第20、30天與第10天比較，呈逐漸下降趨勢。

2.3.2小鼠脾淋巴細胞膜表面分子CD21水平變化 細胞ELISA法檢測免疫后小鼠脾淋巴細胞膜表面分子CD21的表達水平，結(jié)果顯示(見表5)：①裸DNA組和佐劑DNA組高于兩對照組，有顯著性差異(P＜0.05)。②佐劑DNA組高于裸DNA組，有顯著性差異(P＜0.05)。③兩實驗組小鼠血清CD21水平，第20、30天與第10天比較，呈逐漸下降趨勢。

2.4細菌攻擊動物發(fā)病情況 用細菌攻擊小鼠，計算7天疾病指數(shù)的平均值(見表6)，由疾病指數(shù)可知：(1)裸DNA組低于兩對照組，相比有顯著性差異(P＜0.05);(2)佐劑DNA組低于裸DNA組，相比有顯著性差異(P＜0.05);(3)佐劑DNA組明顯低于兩對照組，相比有顯著性差異(P＜0.05)。(4)而兩對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)。

2.5腸道分泌液細菌培養(yǎng)結(jié)果 由腸道分泌液細菌培養(yǎng)結(jié)果(見表7)，由細菌指數(shù)可以看出：(1)裸DNA組的低于兩對照組;(2)佐劑DNA組低于裸DNA組;(3)佐劑DNA組明顯低于兩對照組。

表4 小鼠脾淋巴細胞膜表面分子CD20的OD值檢測結(jié)果Tab.4 OD values of the mouse spleen lymphocyte CD20

表5 小鼠脾淋巴細胞膜表面分子CD21的OD值檢測結(jié)果Tab.5 OD values of the mouse spleen lymphocyte CD21

表6 細菌攻擊后動物發(fā)病情況表Tab.6 The pictures of illness in mice after oral immunization

表7 小鼠腸道分泌液細菌培養(yǎng)結(jié)果表Tab.7 The result of bacilliculture in incubating with intestine fluid of mice

3 討論

空腸彎曲菌感染及其并發(fā)癥危害較大。近20年來國內(nèi)外學(xué)者對其疫苗進行了系列研究探討，主要包括滅活疫苗、減毒疫苗和亞單位疫苗等。卻皆因不同血清型CJ的抗原分子結(jié)構(gòu)差異，或潛在的周圍神經(jīng)免疫損傷，及不便大規(guī)模制備等原因，使得CJ疫苗未取得突破性進展。我們前期部分研究表明CJ亞單位疫苗有一定的發(fā)展前景：馮勝軍等提取CJ外膜蛋白中最具保守性的成份：28～31 kD蛋白，并證明其是一種良好的免疫原，能夠誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性抗體［7］。李成文等［8-11］表明 CJ 28～31 kD蛋白亦具有較好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生良好的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答。本室利用基因工程重組技術(shù)獲得的PEB1重組蛋白免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度特異性抗體和致敏淋巴細胞，證明PEB1重組蛋白具有良好的免疫原性［12］。由于亞單位疫苗制備工藝復(fù)雜，制備成本較高，研發(fā)DNA疫苗成為新的方向。

基因疫苗是通過將含抗原編碼基因的質(zhì)粒DNA直接導(dǎo)入組織細胞，質(zhì)粒DNA在機體局部表達相應(yīng)抗原蛋白，以類似自然感染的方式提呈抗原蛋白，并正確地引導(dǎo)該抗原蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入MHCⅠ類抗原遞呈途徑，或分泌該蛋白使其被抗原提呈細胞(APC)攝取而進入MHCⅡ類抗原遞呈途徑，有效誘導(dǎo)特異性體液免疫和細胞免疫應(yīng)答［13-15］?？乖虻拇_定和獲得是研制基因疫苗的前提和關(guān)鍵。大量研究表明CJ主要外膜蛋白PEB1存在于98%CJ菌體表面，由peb1A基因編碼，用其制備的血清抗體能與多數(shù)不同血清型的CJ發(fā)生免疫反應(yīng)，在自然感染的過程中能有效的刺激機體發(fā)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生有效的保護性抗體，是理想的保護性抗原［16，17］。我們前期研究已成功構(gòu)建空腸彎曲菌pcDNA3.1(-)-peb1A，通過本實驗已證實其免疫原性。

研究表明，裸DNA疫苗直接經(jīng)肌肉注射導(dǎo)入宿主體內(nèi)時，其免疫效果并不理想，尤其是特異性體液免疫應(yīng)答較弱，所以需要選用類型適宜的免疫佐劑來增強疫苗的免疫原性［18］。殼聚糖(Chiotsan)無毒無刺激，具有良好生物相容性，在體內(nèi)可降解吸收，是天然多糖中帶正電荷的高分子物質(zhì)，易形成納米粒子和微球而與DNA結(jié)合，形成聚電解質(zhì)復(fù)合體，具有較強的吸收促進作用，能增加抗原呈遞細胞對疫苗的攝取，目前已廣泛用于 DNA疫苗的遞送［19-23］。通常DNA在裸露的情況下可被DNA酶Ⅰ迅速降解，而在被殼聚糖包被后則可以避免［24］。因此，利用殼聚糖作為基因疫苗的佐劑，在一定時間內(nèi)可保護基因疫苗的免疫原性，從而保證相當數(shù)量的DNA疫苗順利到達抗原吸收和免疫應(yīng)答激活部位，有效發(fā)揮基因疫苗誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的功能［25］。

本實驗采用的肌肉注射法是目前基因疫苗免疫最常用的方法，其免疫機制存在兩種觀點：其一是通過肌細胞T小管系統(tǒng)和穴樣內(nèi)陷將DNA攝入，進入細胞內(nèi)的外源基因在強啟動子的作用下，轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達相應(yīng)的抗原蛋白。另一種觀點認為在DNA疫苗免疫時，肌細胞和注射部位的抗原遞呈細胞均被轉(zhuǎn)染，引起CD4+、CD8-T細胞亞群的同時活化，產(chǎn)生了特異性的免疫應(yīng)答。盡管與其它細胞相比肌細胞轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的效率相對較高，但是也只有1%～2%的肌纖維被轉(zhuǎn)染?？漳c彎曲菌屬于胞外菌感染，主要依靠體液免疫特異性抗體殺滅細菌、中和毒素來發(fā)揮免疫保護作用。IgM是初次免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體;IgG為血清中含量最高的免疫球蛋白，在中和毒素、抗細菌、病毒作用方面，IgG類抗體起著重要的作用。在本實驗中，CJ基因疫苗免疫小鼠后，裸DNA組和佐劑-DNA組與空載體和NS對照組比較，均誘導(dǎo)產(chǎn)生了較高濃度的IgM和IgG，表明CJ基因疫苗具有一定的免疫原性。

B細胞是免疫系統(tǒng)中的抗體產(chǎn)生細胞，它的分化過程主要分為前B細胞、不成熟B細胞、成熟B細胞、活化B細胞和漿細胞五個階段。CD20表達于除漿細胞外的發(fā)育分化各階段的B細胞。CD21主要存在于B淋巴細胞、樹突狀細胞和鼻咽部上皮細胞表面，又稱2型補體受體(CR2)和EB病毒受體，促進B淋巴細胞增殖，但單獨CD21交聯(lián)并不引起B(yǎng)淋巴細胞的增殖。本實驗中，小鼠脾淋巴細胞膜表面分子CD20和CD21的表達水平在免疫后第10、20和30天，裸DNA組和殼聚糖-DNA組均有明顯增高，且殼聚糖-DNA組高于裸DNA組，表明裸DNA和殼聚糖-DNA能增強B細胞的活化，而且殼聚糖-DNA的作用強于裸DNA。裸DNA組和殼聚糖-DNA組CD20和CD21的表達水平第20天和30天與第10天相比呈逐漸降低趨勢，說明在CD20和CD21逐漸消失的同時B細胞活化分化為漿細胞，因此出現(xiàn)在第10天IgM抗體的大量分泌，第20天IgG的大量分泌。細菌攻擊及保護實驗，本試驗用新鮮菌液對昆明種小鼠進行灌胃，以感染、死亡和腸道細菌數(shù)作攻擊保護指標。關(guān)于攻擊實驗結(jié)果分析：由疾病指數(shù)可知，裸DNA組低于兩對照組，相比有統(tǒng)計學(xué)意義;佐劑DNA組低于裸DNA組，相比有統(tǒng)計學(xué)意義;由腸道分泌液細菌培養(yǎng)結(jié)果看出，裸DNA組的細菌指數(shù)低于兩對照組;佐劑DNA組低于裸DNA組;表明佐劑DNA組免疫昆明種小鼠后能有效降低實驗動物的患病率，產(chǎn)生一定的保護力。

本研究結(jié)果表明，CJ pcDNA3.1(-)-peb1A疫苗肌肉注射免疫小鼠后具有免疫原性，殼聚糖能增強pcDNA3.1(-)-peb1A的免疫原性，能介導(dǎo)特異性抗體應(yīng)答，能誘導(dǎo)B細胞在疫苗作用后膜分子的表達，免疫接種小鼠有保護作用。由于CJ感染沒有敏感動物模型，有關(guān)保護性研究僅是一個初步結(jié)果，其確切的效果有待深入研究。

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