榮絡健腦飲對腦缺血再灌注大鼠NGF、BDNF、bFGF表達的影響*

韓 寧 張 青 房位昊

（山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250011）

目前缺血性中風的西醫(yī)治療主要強調(diào)超早期溶栓和保護缺血后腦組織。溶栓的嚴格適應證使其應用受限，神經(jīng)保護劑有廣闊的應用前景，尤其是神經(jīng)營養(yǎng)因子，但因其價格昂貴、難以透過血腦屏障，制約其應用與發(fā)展。中醫(yī)藥在神經(jīng)保護方面發(fā)揮了獨特的優(yōu)勢。本文通過建立腦缺血再灌注模型，從神經(jīng)營養(yǎng)因子合成與釋放角度探討榮絡健腦飲的神經(jīng)保護機制，為中醫(yī)藥對中風的神經(jīng)保護治療提供依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 130只健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量280～300 g，由山東中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（魯）20050015。

1.2 藥物與試劑 兔抗大鼠神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、堿性成纖維生長因子（bFGF）、多克隆抗體、SABC（兔IgG）、DAB顯色劑等，以上試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。榮絡健腦飲：人參12 g（單煎），鹿茸粉3 g（沖），龜甲 12 g（先煎），麥冬 30 g，菖蒲 15 g，川芎 20 g，赤芍 12 g，大黃 9 g，冰片 0.1 g（沖）。補陽還五湯：生黃芪 60 g，當歸尾 12 g，赤芍12 g，川芎20 g，桃仁10 g，紅花15 g，地龍 15 g。 上述藥物購自山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房。按常規(guī)方法制備，加水煎煮兩次，每次1 h，合并煎液，分別濃縮成含生藥1.0、1.3 g/mL的湯劑。

1.3 分組與造模 將大鼠用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、假手術組、模型組、補陽還五湯組、榮絡健腦飲組5組，后4組又分為1、2、7 d 3個亞組，每個亞組10只大鼠。根據(jù)改良Longa法，建立大鼠大腦中動脈栓塞（MCAO）局灶性腦缺血模型。用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔麻醉大鼠，頸部備皮、消毒，沿頸部正中做一切口，分離皮下組織，暴露右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結扎頸外動脈，用動脈夾夾閉頸內(nèi)動脈，距頸總動脈分叉處2 mm扎一小孔，插入栓線，松開動脈夾，插入深度距頸總動脈分叉約（18.5±0.5）mm處，遇阻力即停止進線，固定栓線并結扎，縫合皮下組織及皮膚。缺血1 h后，拔出栓線。參照Zea-Longa 5分制評分標準，于大鼠術后進行評分：0分，無神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失；5分，死亡。神經(jīng)功能缺損程度評分為1～3分的大鼠即為成功模型。假手術組：分離各個血管，然后縫合皮膚。模型組、補陽還五湯組、榮絡健腦飲組：建立MCAO模型，缺血1 h再灌注1、2、7 d。

1.4 給藥方法 正常對照組：日常飼料，自由飲水。其余各組于造模前4 d開始給藥，模型組、假手術組灌胃生理鹽水、補陽還五湯組灌胃補陽還五湯、榮絡健腦飲組灌胃榮絡健腦飲，劑量均為10 mL/kg，每日1次，直至處死。

1.5 標本采集與檢測 10%中性甲醛灌注取腦，后將腦組織固定在甲醛溶液中。充分固定后，從視交叉后3 mm處取大腦中動脈供血區(qū)腦組織2 mm，行石蠟包埋，每一組織蠟塊連續(xù)4 μm切片4張，1張行常規(guī)HE染色，3張分別行 NGF、BDNF、bFGF免疫組化染色。觀察腦缺血1 h再灌注1、2、7 d后，對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損程度評分。對免疫組化切片行計算機定量分析，測出NGF、BDNF、bFGF表達的平均灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用經(jīng)q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分比較 見表1。各組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分有隨時間而變化的趨勢，但時間因素的作用不隨分組的不同而不同，而且總體而言各組有差異。每個時間點上各組比較，榮絡健腦飲組大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分在不同時間點較模型組均明顯改善（P＜0.05）。在腦缺血再灌注第2日、第7日，榮絡健腦飲在改善大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分方面優(yōu)于補陽還五湯（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損程度評分（分，±s）

表1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損程度評分（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與補陽還五湯組比較，△P＜0.05。下同。

組 別 第2日 第7日正常對照組 - 0 n 第1日10 -假手術組 0 0 10 0模型組 10 2.83±0.41 2.50±0.55 1.83±0.41補陽還五湯組 10 2.33±0.52 1.83±0.41* 1.33±0.52*榮絡健腦飲組 10 1.86±0.38* 1.14±0.38*△ 0.71±0.49*△

2.2 HE染色切片在光鏡下觀察結果 正常對照組和假手術組大鼠皮質(zhì)、髓質(zhì)未見明顯病理改變。模型組可見較大的灶性水腫或軟化灶形成，胞核變性、壞死，甚則細胞溶解、消失，并伴慢性炎性細胞浸潤，或伴間質(zhì)細胞增生，部分成纖維細胞增生、纖維化形成。補陽還五湯組和榮絡健腦飲組與相應時間點的模型組比較病理改變程度較輕，其中以榮絡健腦飲組最輕。

2.3 各組大鼠腦組織神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達 見表2～表4。與同時段的模型組、補陽還五湯組比較，榮絡健腦飲組各神經(jīng)營養(yǎng)因子的陽性表達均增強，差異有統(tǒng)計學意義。在腦缺血再灌注1、2、7 d不同的時間點補陽還五湯組大鼠腦組織NGF、BDNF的表達均增強，對bFGF的影響于缺血再灌注第2、7日顯著，與模型組比較有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠腦組織NGF表達平均灰度值比較（±s）

表2 各組大鼠腦組織NGF表達平均灰度值比較（±s）

組 別 第2日 第7日正常對照組 153.42±6.70 153.42±6.70 n 第1日10 153.42±6.70假手術組 159.08±5.59 157.14±7.15 10 153.90±8.54模型組 10 133.66±7.23 127.99±9.70 135.48±7.98補陽還五湯組 10 118.41±6.75* 113.53±3.77* 126.46±7.34*榮絡健腦飲組 10 109.05±7.56*△ 104.87±8.14*△ 115.23±4.93*△

表3 各組大鼠腦組織BDNF表達平均灰度值比較（±s）

表3 各組大鼠腦組織BDNF表達平均灰度值比較（±s）

組 別 第2日 第7日正常對照組 163.42±6.41 163.42±6.41 n 第1日10 163.42±6.41假手術組 162.16±4.89 161.73±9.12 10 160.90±6.69模型組 10 121.66±10.37 135.31±7.08 138.30±7.05補陽還五湯組 10 112.41±6.49* 122.83±8.72* 132.53±8.75*榮絡健腦飲組 10 103.05±6.37*△ 112.26±8.10*△ 119.79±7.13*△

表4 各組大鼠腦組織bFGF表達平均灰度值比較（±s）

表4 各組大鼠腦組織bFGF表達平均灰度值比較（±s）

組 別 第2日 第7日正常對照組 161.62±6.55 161.62±6.55 n 第1日10 161.62±6.55假手術組 158.62±5.29 155.48±8.14 10 159.69±6.30模型組 10 141.09±7.29 130.70±8.23 142.62±8.28補陽還五湯組 10 132.97±11.12 123.62±5.40* 130.02±4.88*榮絡健腦飲組 10 121.50±8.56*△ 109.81±6.98*△ 120.64±6.00*△

3 討 論

神經(jīng)營養(yǎng)因子是一種調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、促進神經(jīng)系統(tǒng)成熟、維持神經(jīng)功能的蛋白質(zhì)。其中發(fā)現(xiàn)最早的是NGF，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子。腦損傷時腦內(nèi)源性NGF在皮層和海馬區(qū)域的表達增加［1-2］，對神經(jīng)元起保護作用。而且外源性NGF的應用可減少梗死體積并減輕腦水腫［3］。將鼠神經(jīng)生長因子用于臨床，發(fā)現(xiàn)其能有效減少患者的神經(jīng)功能缺損程度評分，是一種有效治療急性腦梗死的藥物［4］。

BDNF是一種在神經(jīng)元損傷后再生修復和防止神經(jīng)細胞退行性變等多方面發(fā)揮重要作用的細胞因子［5］。腦缺血再灌注損傷可誘導BDNF極早表達，從多個方面抑制各種缺血再灌注損傷反應。如BDNF可誘導鈣結合蛋白表達從而穩(wěn)定細胞內(nèi)Ca2+濃度［6］；下調(diào)N-甲基-D-天冬氨酸受體功能，以此拮抗興奮性氨基酸的毒性［7］；抑制誘導型一氧化氮合酶的表達、膠質(zhì)細胞的活性和巨噬細胞的浸潤，自由基的生成［8］；通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl表達抑制β-淀粉樣蛋白誘導的細胞凋亡［9］等。

bFGF是FGF家族9個成員之一，不但能促進細胞增生分化和血管生成，還可明顯減輕缺血性腦損傷［10］。MCAO后缺血側(cè)幾個腦區(qū)的bFGF mRNA與bFGF免疫反應增加［11］，bFGF表達后可通過調(diào)控HSP70蛋白和p53凋亡相關基因而發(fā)揮抗缺血性腦損傷的作用［12］。

筆者將內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子歸屬于中醫(yī)“精”的范疇，并認為肝腎陰虛、氣血衰少是致病之本，痰瘀阻絡、腦髓失養(yǎng)是疾病難愈的主因。補腎益精、榮絡活血，則可使腦髓充盈，元神功能正常，中風時出現(xiàn)的神昏、半身不遂、偏身麻木等癥狀得以恢復。據(jù)此，筆者擬定了具有益氣填精、榮絡活血功效的榮絡健腦飲治療中風。方中多味中藥均可抵抗腦缺血再灌注損傷，且菖蒲、冰片引藥入腦，促進其發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本研究結果表明榮絡健腦飲可減輕腦缺血再灌注損傷造成的病理改變，降低腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損程度評分，促進腦組織NGF、BDNF、bFGF的表達，與補陽還五湯比較，有顯著差異。促進腦組織NTF的表達是榮絡健腦飲的神經(jīng)保護機制之一。本研究從神經(jīng)營養(yǎng)因子合成與釋放角度，進一步闡釋了扶正護腦法治療缺血性中風的作用靶點，為中醫(yī)藥對中風的神經(jīng)保護治療提供了依據(jù)。

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