卵巢癌患者術(shù)前、術(shù)后、復(fù)發(fā)及化療過程中血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)研究

趙 晉，湯 泓，李紅霞

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京100038）

卵巢癌是一種多因素、多基因參與的復(fù)雜疾病。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人們更加清楚地認(rèn)識到：基因組是一個(gè)靜態(tài)的信息源，它具有確定的基因內(nèi)容，即無論細(xì)胞類型或環(huán)境條件如何，除極少數(shù)情況外，它總是維持不變。因此，基因間的功能關(guān)系必須在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組水平上加以研究。蛋白質(zhì)組（proteomics）是在一定條件下由一個(gè)特定的細(xì)胞或生物體產(chǎn)生的所有蛋白質(zhì)。細(xì)胞通過調(diào)控其蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和活性來適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境的改變，所以，蛋白質(zhì)組無論是在質(zhì)或量上的改變都反映了處于功能活動(dòng)中的細(xì)胞的一種狀況［1，2］。因此用蛋白質(zhì)組學(xué)方法從整體水平上研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找腫瘤診斷和預(yù)后的特異性標(biāo)志物，以及藥物治療的靶標(biāo)等均已成為近期研究的熱點(diǎn)。

本研究采用最常用的一種蛋白指紋圖譜技術(shù)——表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI－TOF－MS），對就診于我院并進(jìn)行手術(shù)治療及術(shù)后化療的9例卵巢癌患者進(jìn)行了跟蹤隨訪，共收集到37份血清標(biāo)本。對上述標(biāo)本分別進(jìn)行了蛋白質(zhì)譜分析，觀察卵巢癌患者術(shù)前、術(shù)后、復(fù)發(fā)及化療過程中血清蛋白質(zhì)變化，探討卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)過程中血清質(zhì)譜多肽蛋白圖譜變化，旨在篩選新的與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展與復(fù)發(fā)密切相關(guān)的蛋白質(zhì)或多肽，為臨床診斷卵巢癌提供可能的血清腫瘤標(biāo)志分子。

1 材料和方法

1.1 研究對象

所有血清標(biāo)本均取自北京世紀(jì)壇醫(yī)院婦科初診卵巢癌患者。7例卵巢癌患者的年齡為40－69歲，平均52.8歲。均為漿液性腺癌。均收集術(shù)前（7份）、術(shù)后（不同時(shí)間22份）血清標(biāo)本。其中復(fù)發(fā)患者3例，包括復(fù)發(fā)后（不同時(shí)間8份）血清標(biāo)本。血清標(biāo)本總數(shù)共37份。

按2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）手術(shù)病理分期，Ⅰ期1例，Ⅱ期3例，Ⅲ期5例。術(shù)式均采用腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)，均在術(shù)后2周內(nèi)開始接受正規(guī)化療，采用化療方案為Pt（順鉑＋紫杉醇）或PC（順鉑＋環(huán)磷酰胺）。所有患者的組織標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)。

1.2 主要試劑與儀器

尿素（urea）、乙腈（CAN）、3－環(huán)乙胺－1－丙磺酸（CHAPS）、三氟乙酸（TFA）、芥子酸（SPA）均購自Sigma公司；SELDI質(zhì)譜儀及CM 10弱陽離子芯片購自于美國BIORAD公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的收集與血清樣本制備 將采集的靜脈血4℃靜置2h后離心（4 000rpm，10min），取上清液按100μl/管分裝，置于－80℃冰箱中保存，凍存前在標(biāo)本管上詳細(xì)標(biāo)號。－80℃冰箱中取出血清樣品，置冰盒上融解；以10，000rpm，4℃離心2 min；每個(gè)樣品取10μl分別置于1.5ml離心管中，加20μl U9緩沖液稀釋，充分混勻；將以上樣品冰浴振蕩30min（或每隔5min用手指輕彈混勻一次）。將30μl上述變性后樣品加入370μl相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，使得血清的總稀釋倍數(shù)達(dá)到40倍。混勻，避免氣泡產(chǎn)生。

1.3.2 SELDI－TOF－MS檢測 取出 CM10的芯片，在芯片背后標(biāo)記時(shí)間，芯片種類，操作者的姓名等資料。將芯片裝入生物芯片處理器。每孔加入200μl結(jié)合緩沖液（50mM NaAC，pH 4.0），置振蕩器400－600rpm/min震蕩5min，甩掉緩沖液。重復(fù)上述操作一次。在芯片處理器每孔中加入100μl處理好的樣品，置振蕩器400－600轉(zhuǎn)/min，4℃震蕩1h。甩出樣品，重復(fù)操作一次。每孔加入200μl HPLC水，立刻甩出。立刻拆開芯片處理器，取出芯片后，待干后，在每個(gè)加樣孔上加SPA 0.5μl，待干后，重復(fù)加SPA 0.5μl一次。待干后，即可上機(jī)測定。

在讀取數(shù)據(jù)前，用加有All－in－one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正質(zhì)譜儀，使分子量誤差＜0.1%。設(shè)定儀器主要參數(shù)：激光強(qiáng)度130，檢測靈敏度8，優(yōu)化分子量范圍2 000－15 000Da，最佳聚焦中心6000，數(shù)據(jù)采集參數(shù)范圍20－80，收集點(diǎn)數(shù)為100次。設(shè)定讀片程序，計(jì)算機(jī)根據(jù)所獲得的原始數(shù)據(jù)快速精確地繪制出蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖，其中縱坐標(biāo)為波峰強(qiáng)度，即蛋白質(zhì)相對含量，橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比（M/Z），即蛋白質(zhì)相對分子量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用Biomarker Wizard和Patterns軟件分析處理所有峰譜，形成蛋白指紋圖譜。用SPSS 13.0軟件對各組血清的波峰強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（符合方差齊性的應(yīng)用方差分析，不符合方差齊性的用多個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)），然后應(yīng)用Biomarker Patterns軟件建立樹形分類模型。

2 結(jié)果

2.1 通過SPSS 13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，在7份卵巢癌術(shù)前、22份卵巢癌術(shù)后及8份復(fù)發(fā)性卵巢癌患者的血清蛋白中共檢測到26個(gè)差異表達(dá)的蛋白（P＜0.05）。

在卵巢癌術(shù)前、術(shù)后自身對照研究中，卵巢癌術(shù)前組蛋白峰平均強(qiáng)度/卵巢癌術(shù)后組蛋白峰平均強(qiáng)度≥2的蛋白峰有1個(gè)（1452.58Da），說明該蛋白峰在卵巢癌術(shù)前組中高表達(dá)。卵巢癌術(shù)前組蛋白峰平均強(qiáng)度/卵巢癌術(shù)后組蛋白峰平均強(qiáng)度≤0.5的蛋白峰有4個(gè)（8785.20，1659.79Da，4253.91Da，5603.31Da），其中 m/z為8785.20的蛋白峰與Apo C－Ⅲ的質(zhì)核比相符。說明該蛋白峰在卵巢癌術(shù)前組中低表達(dá)。

2.2 在卵巢癌術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)組對照研究中，差異表達(dá)的蛋白峰有2個(gè)，其中m/z7991.89Da的蛋白峰術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)時(shí)的蛋白質(zhì)平均強(qiáng)度分別為14.67、5.75、12.28（P值＝0.002）；m/z 8093.54Da的蛋白峰術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)時(shí)的蛋白質(zhì)平均強(qiáng)度分別為3.12、0.71、2.81（P值＝0.002）。

3 討論

3.1 患者手術(shù)前后差異表達(dá)的蛋白峰的意義

卵巢惡性腫瘤的發(fā)病率，在女性常見惡性腫瘤中所占的百分率為2.4%－5.6%。在女性生殖道癌瘤中占第3位，次于宮頸癌及宮體癌。而在女性生殖道癌瘤中，卵巢癌是死亡率最高的一種腫瘤［3］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前卵巢癌總的治療有效率為70%－80%，然而經(jīng)病理學(xué)證實(shí)完全有效者，復(fù)發(fā)率仍為40%－60%。因此，對卵巢癌患者進(jìn)行有效的隨訪觀察，盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)具有重要的意義。

本研究選取了7位卵巢癌患者進(jìn)行手術(shù)前后自身對照研究。我們設(shè)想的是，手術(shù)可明顯減少腫瘤負(fù)荷，因此，應(yīng)用SELDI－TOF－MS技術(shù)檢測卵巢癌患者手術(shù)前后自身對照血清蛋白質(zhì)成分的改變，有望了解患者進(jìn)行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)的效果和機(jī)體對手術(shù)的反應(yīng)程度，并可篩選出評價(jià)手術(shù)效果及判定復(fù)發(fā)的潛在標(biāo)志物。結(jié)果顯示卵巢癌患者在術(shù)前及術(shù)后存在差異表達(dá)的蛋白峰，這些蛋白峰可能來自自于宿主器官、病變本身或機(jī)體的代謝或免疫產(chǎn)物，得到有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白峰5個(gè)，推測它們可能是卵巢癌發(fā)生及發(fā)展中具有功能的一組蛋白或多肽。其中卵巢癌術(shù)前組蛋白峰平均強(qiáng)度/卵巢癌術(shù)后組蛋白峰平均強(qiáng)度≥2的蛋白峰有1個(gè)（1452.58Da），說明該蛋白峰在卵巢癌術(shù)前組中高表達(dá)。推測可能是因?yàn)樵摰鞍自谀[瘤組織中表達(dá)增強(qiáng)，可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而術(shù)后腫瘤負(fù)荷降低，該蛋白峰表達(dá)下降。卵巢癌術(shù)前組蛋白峰平均強(qiáng)度/卵巢癌術(shù)后組蛋白峰平均強(qiáng)度≤0.5的蛋白峰有4個(gè)（8785.20，1659.79Da，4253.91Da，5603.31Da），說明該蛋白峰在卵巢癌術(shù)前組中低表達(dá)。推測可能是機(jī)體產(chǎn)生的重要的保護(hù)因素或抑癌因子，術(shù)后腫瘤負(fù)荷降低，對免疫因子的消耗減少，故術(shù)后血清中相應(yīng)蛋白含量升高；也有可能是與代謝有關(guān)的蛋白，術(shù)后腫瘤負(fù)荷降低，代謝水平降低，消耗較少，故相應(yīng)蛋白水平升高。本研究中，通過對蛋白質(zhì)組學(xué)的同源性分析，發(fā)現(xiàn)m/z為8785.20的蛋白峰與載脂蛋白Apo C－Ⅲ的質(zhì)核比相符。觀察該蛋白峰在術(shù)前術(shù)后及復(fù)發(fā)時(shí)的變化，可見該蛋白峰在術(shù)前低表達(dá)，術(shù)后表達(dá)升高，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［4－6］。說明該蛋白峰與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。推測其可能因腫瘤存在，代謝旺盛，腫瘤負(fù)荷加大了該蛋白的消耗。

3.2 卵巢癌復(fù)發(fā)患者差異表達(dá)的蛋白峰的意義

在卵巢癌領(lǐng)域內(nèi)，盡管迄今對復(fù)發(fā)性卵巢癌的治療仍為姑息性治療，但是，對于復(fù)發(fā)性卵巢癌患者來說，及早明確診斷并治療，對于延長生存時(shí)間及改善生存質(zhì)量有著重要意義。本研究中，我們選取了卵巢癌術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)組進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)對比研究，我們設(shè)想的是，手術(shù)可明顯減少腫瘤負(fù)荷，而術(shù)后復(fù)發(fā)，腫瘤負(fù)荷再次加大，蛋白峰的變化應(yīng)與術(shù)前－術(shù)后的變化趨勢相反，但術(shù)前及復(fù)發(fā)組因腫瘤負(fù)荷不同，故變化幅度可能會(huì)與術(shù)前－術(shù)后不同。因此，應(yīng)用SELDI－TOF－MS技術(shù)檢測卵巢癌患者手術(shù)前后及復(fù)發(fā)組對照血清蛋白質(zhì)成分的改變，有望了解手術(shù)及腫瘤復(fù)發(fā)對機(jī)體影響及機(jī)體的反應(yīng)，并可篩選出評價(jià)手術(shù)效果及判定復(fù)發(fā)的潛在標(biāo)志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)符合卵巢癌術(shù)前組峰值平均強(qiáng)度/術(shù)后組峰值平均強(qiáng)度≥2且卵巢癌術(shù)后組峰值平均強(qiáng)度/復(fù)發(fā)組峰值平均強(qiáng)度≤0.5的蛋白峰有2個(gè)（7991.89Da，8093.54Da）說明該蛋白峰在機(jī)體存在腫瘤時(shí)表達(dá)增強(qiáng)。推測該蛋白峰可能來自于腫瘤組織，在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中不斷釋放入血而引起血清該蛋白或肽段含量升高。

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