抗氧化酶基因轉(zhuǎn)染治療心血管疾病的研究進(jìn)展

姜宜成 沈成興

氧化應(yīng)激損傷是多種心血管疾病的主要發(fā)病機(jī)制，運(yùn)用抗氧化劑或氧自由基清除劑的抗氧化應(yīng)激作用能夠預(yù)防和治療多種心血管疾病。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，理論上通過(guò)抗氧化劑基因轉(zhuǎn)染高表達(dá)抗氧化劑產(chǎn)物來(lái)清除氧自由基可能會(huì)取得更優(yōu)越的效果，且這種方法已在多種動(dòng)物模型中實(shí)驗(yàn)成功。我們主要就抗氧化劑基因轉(zhuǎn)染在防治心血管疾病方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 心血管疾病中氧化應(yīng)激損傷發(fā)生機(jī)制

心血管疾病已成為危害人類健康的第一殺手。在多種心血管疾病的發(fā)病機(jī)制中，氧化應(yīng)激損傷起到了關(guān)鍵性作用，包括心肌病、心力衰竭、心肌梗死、心肌缺血/再灌注損傷、動(dòng)脈粥樣硬化、內(nèi)皮功能障礙、冠狀動(dòng)脈再狹窄和高血壓等［1-5］。藥物、炎癥、缺血及環(huán)境污染，甚至精神壓力等因素均可引起機(jī)體氧自由基(O2-)和活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加，如果這些影響因素過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，過(guò)度消耗了體內(nèi)的抗氧化劑，機(jī)體氧化還原平衡狀態(tài)將被打破，即發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷。其分子機(jī)制為:血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生ROS是通過(guò)還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的非吞噬細(xì)胞氧化酶(non-phagocytic cell oxidase，NOX)，解耦合內(nèi)皮 NO合成酶(nitric oxide syntheses，NOS)和線粒體呼吸作用。ROS可引起脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化。脂質(zhì)氧化不但能產(chǎn)生細(xì)胞毒性代謝產(chǎn)物，還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層的破裂。蛋白質(zhì)氧化導(dǎo)致其巰基或甲硫氨酸殘基結(jié)構(gòu)氧化使之構(gòu)象改變、斷裂和交聯(lián)形成聚合體。蛋白質(zhì)的氧化還原狀態(tài)改變?cè)诩?xì)胞功能上包括基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞代謝、離子穩(wěn)態(tài)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面起到重要作用。氧化還原介導(dǎo)的離子通道或離子泵活性的改變導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2+在缺血/再灌注損傷時(shí)顯著升高。氧化應(yīng)激損傷中產(chǎn)生的ROS直接影響鈣聯(lián)蛋白包括理阿諾堿受體(RyR)、SR-Ca2+-ATPase(SERCA)和肌醇-IP3-Ca2+釋放通道［6］。另一些心臟興奮-收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵成分也易于被氧化還原修飾，如 SERCA、L型 Ca2+通道［7］。在心臟缺血/再灌注中ROS產(chǎn)生明顯增加導(dǎo)致主要鈣調(diào)控蛋白活性改變，可能對(duì)缺血/再灌注相關(guān)的心肌細(xì)胞內(nèi)鈣過(guò)載起到重要作用。ROS同樣能通過(guò)氧化還原反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感的轉(zhuǎn)錄因子如核轉(zhuǎn)錄因子κB(neuclear factorκB，NF-κB)和激活蛋白 1(activator protein-1，AP-1)等。因此，NF-κB和AP-1代表了對(duì)氧化還原敏感的分子靶向，這些轉(zhuǎn)錄因子的激活是誘導(dǎo)前炎癥基因表達(dá)的前提［6］。

2 抗氧化酶在心血管疾病中的作用

抗氧化酶在保持機(jī)體精確的氧化還原平衡狀態(tài)、維持正常的生理功能及應(yīng)對(duì)內(nèi)源性或外源性氧化應(yīng)激反應(yīng)中均起重要的作用。已知的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(glutathione peroxidase，GPx)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)或血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)，這些酶可被炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷或其他應(yīng)激損害誘導(dǎo)產(chǎn)生，其中SOD和HO-1對(duì)心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用研究較多。

SOD是ROS的主要清除劑，它催化O2-發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生過(guò)氧化氫(H2O2)和分子氧(O2)。H2O2在CAT、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)和抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)系統(tǒng)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)樗脱鯕?。SOD有3種同工酶，分別是Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和EC-SOD，每種表達(dá)于獨(dú)立的細(xì)胞亞群，分別在不同區(qū)域發(fā)揮抗氧化作用。Cu/Zn-SOD分布于所有類型細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，發(fā)揮細(xì)胞內(nèi)抗氧化的作用。Mn-SOD主要分布于線粒體內(nèi)。EC-SOD專一分布及分泌于細(xì)胞外的特性使抗氧化保護(hù)的作用從細(xì)胞內(nèi)到細(xì)胞外均能得到發(fā)揮。在EC-SOD基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞裂解物或培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)SOD活性增高［8］。細(xì)胞內(nèi)SOD能阻止細(xì)胞外O2-跨細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

CAT是強(qiáng)有力的H2O2清除劑，具有抑制毒性HO-形成的作用。因此，可利用CAT的抗氧化特性來(lái)應(yīng)對(duì)缺血導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

GPx是一種廣泛存在于線粒體和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的抗氧化酶，是心臟抗過(guò)氧化物損傷最主要的酶，但在缺血條件下因失活而不能發(fā)揮作用［9］。

HO-1是膽紅素代謝的關(guān)鍵酶，HO-1以NADPH為輔因子來(lái)催化膽紅素氧化降解為膽綠素、一氧化碳和鐵［10］。在膽綠素還原酶催化的膽綠素轉(zhuǎn)化為膽紅素的過(guò)程中繼發(fā)性地清除ROS。由于其作用于血管床的特點(diǎn)，有研究顯示HO-1高表達(dá)可預(yù)防心肌缺血性損傷的發(fā)生，可通過(guò)誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)或過(guò)表達(dá)來(lái)預(yù)防心肌缺血性損傷的發(fā)生［11］。

3 心血管疾病的抗氧化酶基因治療

心血管疾病的抗氧化酶基因治療原理是將抗氧化酶基因?qū)胄难芟到y(tǒng)，并在特定部位表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，從而取得治療心血管疾病的目的。

HO-1是最具特征的心血管疾病保護(hù)基因。HO-1基因轉(zhuǎn)染治療在一些動(dòng)物模型中包括自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)［12］、心臟缺血/再灌注損傷［13-15］和頸動(dòng)脈或股動(dòng)脈血管球囊成形術(shù)均取得了效果。特別指出，在一項(xiàng)以心臟缺血/再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行HO-1基因轉(zhuǎn)移治療的研究中發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積減小，與此同時(shí)心肌脂質(zhì)過(guò)氧化、凋亡前體蛋白和促炎性細(xì)胞因子IL-1β的水平均降低，還伴有抗凋亡蛋白Bcl-2水平的升高，表明HO-1還能通過(guò)降低氧化應(yīng)激及相關(guān)炎癥和細(xì)胞凋亡而增加其心臟保護(hù)效果［14］。HO-1基因轉(zhuǎn)移治療不但能恢復(fù)左心室容積和功能，還能減輕心肌纖維化和心室重構(gòu)。

血管損傷是以炎癥反應(yīng)伴局部修復(fù)過(guò)程為特征的，這點(diǎn)支持HO-1在血管修復(fù)中的保護(hù)性作用。以往研究表明，在實(shí)驗(yàn)性血管損傷之后新生內(nèi)膜HO-1誘導(dǎo)衰減［16］。HO-1通過(guò)兩條以上的非一氧化氮依賴性途徑來(lái)減輕血管損傷的嚴(yán)重程度［17］。在血管損傷中HO-1直接降低血管收縮和抑制細(xì)胞增生。血管表達(dá)的HO-1通過(guò)鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和環(huán)單磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)介導(dǎo)，不依賴一氧化氮直接刺激血管舒張。此外，HO-1通過(guò)細(xì)胞周期停滯直接抑制血管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)。再者，HO-1腺病毒基因轉(zhuǎn)移已經(jīng)顯示出能減少載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)缺乏動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型的粥樣硬化病變［18］。這些研究表明，HO-1可能代表一種體內(nèi)重要的血管保護(hù)介質(zhì)，它能夠降低血管內(nèi)損傷后的重構(gòu)反應(yīng)。

以SOD誘導(dǎo)的基因治療包括 EC-SOD、Mn-SOD、Cu/Zn-SOD均已經(jīng)在多種動(dòng)物模型中實(shí)驗(yàn)過(guò)。EC-SOD被用來(lái)成功地降低了SHR模型的血壓［19］，減少球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)模型的再狹窄發(fā)生［20-21］，減少心臟缺血再灌注模型的梗死面積［22-23］。EC-SOD基因治療組相對(duì)于對(duì)照組顯著地減少了缺血30min后再灌注的兔心肌梗死模型的梗死面積。最近的一項(xiàng)研究進(jìn)一步支持和驗(yàn)證了早期研究得出的利用重組腺病毒相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)轉(zhuǎn)導(dǎo) ECSOD基因?qū)θ毖?再灌注大鼠模型心臟進(jìn)行預(yù)防性保護(hù)性治療，能夠延長(zhǎng)生存和改善心室功能的結(jié)論［23］。EC-SOD基因先于心肌損傷6周轉(zhuǎn)導(dǎo)。EC-SOD基因治療組通過(guò)減小缺血/再灌注損傷24 h后的梗死面積、提高7周后左心室功能及提高長(zhǎng)期生存率表現(xiàn)出顯著的心肌保護(hù)作用。研究提供了預(yù)先基因治療的有利證據(jù)和其通過(guò)表達(dá)分泌型蛋白并以旁分泌方式來(lái)保護(hù)心臟免于即將受到的損傷而達(dá)到心臟保護(hù)效果［23］。

Mn-SOD和Cu/Zn-SOD也顯示出類似的改善心臟缺血/再灌注損傷的效果［24-25］。已經(jīng)在心臟缺血/再灌注大鼠模型上通過(guò)重組腺病毒表達(dá)Mn-SOD和Cu/Zn-SOD分別調(diào)節(jié)線粒體和細(xì)胞質(zhì)的超氧化水平對(duì)這種效果的可能機(jī)制進(jìn)行了研究。Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的異位表達(dá)保護(hù)了缺血/再灌注的心肌，相對(duì)于對(duì)照組它們能顯著地減少心肌梗死面積和心肌細(xì)胞凋亡。此外，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的表達(dá)推遲了心肌缺血/再灌注損傷后轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和AP-1的激活。對(duì)凋亡前和抗凋亡基因蛋白表達(dá)進(jìn)一步的分析顯示，異位SOD表達(dá)導(dǎo)致基因表達(dá)的改變與抗凋亡的保護(hù)性效果一致。研究結(jié)果支持無(wú)論是線粒體還是細(xì)胞質(zhì)源性的SOD同工酶都能至少部分性地通過(guò)改變NF-κB和AP-1的激活來(lái)發(fā)揮抗缺血/再灌注損傷效果的觀點(diǎn)［24］。

抗氧化治療球囊擴(kuò)張損傷的成功是令人興奮的一個(gè)新領(lǐng)域。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)作為冠狀動(dòng)脈成形術(shù)被廣泛應(yīng)用于治療急性冠脈綜合征和慢性缺血性心臟病。之前研究已經(jīng)證實(shí)，球囊擴(kuò)張成形術(shù)能引發(fā)急性全身氧化應(yīng)激反應(yīng)，局部產(chǎn)生增多和血管SOD活性降低［26-28］，PCI術(shù)后再狹窄發(fā)生率高。因此，藥物洗脫支架廣泛用于置入狹窄的冠狀動(dòng)脈，利用藥物的緩釋來(lái)阻止細(xì)胞增生，支架可以阻止血管回縮和再狹窄發(fā)生。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示治療原發(fā)冠狀動(dòng)脈狹窄，藥物洗脫支架的效果優(yōu)于金屬裸支架，發(fā)生主要心血管事件的幾率降低，藥物洗脫支架已被美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于當(dāng)前的臨床治療。第一代藥物洗脫支架包被西羅莫司或紫杉醇來(lái)預(yù)防再狹窄。然而，一些研究顯示支架置入術(shù)后期血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)增高［29-30］。鑒于上述問(wèn)題，一些新型支架系統(tǒng)正在研發(fā)。一項(xiàng)研究顯示，在球囊擴(kuò)張血管成形術(shù)動(dòng)物模型上應(yīng)用EC-SOD基因治療預(yù)防再狹窄的發(fā)生取得了有益效果［21］。因此，應(yīng)用病毒載體直接對(duì)氧化應(yīng)激進(jìn)行局部治療也許是一種應(yīng)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化治療中支架介導(dǎo)的血管損傷的值得研究的策略。

4 前景與展望

隨著人口老齡化這個(gè)世界性問(wèn)題日益突出，心血管疾病的發(fā)病率、病死率及致殘率將逐漸升高，對(duì)人類的威脅也愈加嚴(yán)重。鑒于抗氧化酶基因轉(zhuǎn)染方法在臨床前的研究中取得了預(yù)防和治療多種心血管疾病的積極效果，因此，一旦證明這種創(chuàng)新的基因轉(zhuǎn)染方法在臨床應(yīng)用上是可行的和安全的，這種方法將使數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的心血管疾病患者從中獲益。

［1］Abrescia P，Golino P. Free radicals and antioxidants in cardiovascular diseases.Expert Rev Cardiovasc Ther，2005，3:159-171.

［2］Cantor EJ，Mancini EV，Seth R，et al.Oxidative stress and heart disease:cardiac dysfunction，nutrition，and gene therapy.Curr Hypertens Rep，2003，5:215-220.

［3］Park JG，Oh GT.The role of peroxidases in the pathogenesis of atherosclerosis.BMB Rep，2011，44:497-505.

［4］Higashi Y，Nishioka K，Umemura T，et al.Oxidative stress，endothelial function and angiogenesis induced by cell therapy and gene therapy.Curr Pharm Biotechnol，2006，7:109-116.

［5］Levonen AL，V?h?kangas E，Koponen JK，et al.Antioxidant gene therapy for cardiovascular disease:current status and future perspectives.Circulation，2008，117:2142-2150.

［6］Zima AV，Blatter LA.Redox regulation of cardiac calcium channels and transporters.Cardiovasc Res，2006，71:310-321.

［7］Hu H，Chiamvimonvat N，Yamagishi T，et al.Direct inhibition of expressed cardiac L-type Ca2+channels by S-nitrosothiol nitric oxide donors.Circ Res，1997，81:742-752.

［8］Zhang Y，Gu J，Zhao L，et al.Complete elimination of colorectal tumor xenograft by combined manganese superoxide dismutase with tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand gene virotherapy.Cancer Res，2006，66:4291-4298.

［9］Zhu HL，Stewart AS，Taylor MD，et al.Blocking free radical production via adenoviralgene transfer decreases cardiac ischemia-reperfusion injury.Mol Ther，2000，2:470-475.

［10］Loboda A，Jazwa A， Grochot-Przeczek A， etal. Heme oxygenase-1 and the vascular bed:from molecular mechanisms to therapeutic opportunities.Antioxid Redox Signal，2008，10:1767-1812.

［11］Pachori AS，Melo LG， Zhang L， et al. Chronic recurrent myocardial ischemic injury is significantly attenuated by preemptive adeno-associated virus heme oxygenase-1 gene delivery.J Am Coll Cardiol，2006，47:635-643.

［12］Sabaawy HE，ZhangF， NguyenX， etal. Humanheme oxygenase-1 gene transfer lowers blood pressure and promotes growth in spontaneously hypertensive rats.Hypertension，2001，38:210-215.

［13］Liu X，SimpsonJA， BruntKR， etal. Preemptiveheme oxygenase-1 gene delivery reveals reduced mortality and preservation of left ventricular function 1 yr after acute myocardial infarction.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293:H48-59.

［14］Melo LG，Agrawal R，Zhang L，et al.Gene therapy strategy for long-term myocardial protection using adeno-associated virusmediated delivery of heme oxygenase gene.Circulation，2002，105:602-607.

［15］Liu X，Pachori AS，Ward CA，et al.Heme oxygenase-1(HO-1)inhibits postmyocardial infarct remodeling and restores ventricular function.FASEB J，2006，20:207-216 .

［16］Tulis DA，Durante W，Liu X，et al.Adenovirus-mediated heme oxygenase-1 gene delivery inhibits injury-induced vascular neointima formation.Circulation，2001，104:2710-2715.

［17］Hyvelin JM，Maurel B，Uzbekov R，et al.Hemin prevents instent stenosis in rat and rabbit models by inducing hemeoxygenase-1.J Vasc Surg，2010，51:417-428.

［18］Juan SH，Lee TS，Tseng KW，et al.Adenovirus-mediated heme oxygenase-1 gene transfer inhibits the development of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice.Circulation，2001，104:1519-1525.

［19］Chu Y，Iida S，Lund DD，et al.Gene transfer of extracellular superoxide dismutase reduces arterial pressure in spontaneously hypertensive rats:role of heparin-binding domain.Circ Res，2003，92:461-468.

［20］Laukkanen MO，Kivel? A，Rissanen T， et al.Adenovirusmediated extracellular superoxide dismutase gene therapy reduces neointima formation in balloon-denuded rabbit aorta.Circulation，2002，106:1999-2003.

［21］Br?sen JH，Lepp?nen O， Inkala M， etal. Extracellular superoxide dismutase accelerates endothelial recovery and inhibits in-stent restenosis in stented atherosclerotic Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit aorta.J Am Coll Cardiol，2007，50:2249-2253.

［22］Seshadri G，Sy JC，Brown M，et al.The delivery of superoxide dismutase encapsulated in polyketalmicroparticles to rat myocardium and protection from myocardial ischemia-reperfusion injury.Biomaterials，2010，31:1372-1379.

［23］Agrawal RS，Muangman S，Layne MD，et al.Pre-emptive gene therapy using recombinant adeno-associated virus delivery of extracellular superoxide dismutase protects heart against ischemic reperfusion injury，improves ventricular function and prolongs survival.Gene Ther，2004，11:962-969.

［24］Yang J，Marden JJ，F(xiàn)an C，et al.Genetic redox preconditioning differentially modulates AP-1 and NF kappa B responses following cardiac ischemia/reperfusion injury and protects against necrosis and apoptosis.Mol Ther，2003，7:341-353.

［25］Woo YJ，ZhangJC， VijayasarathyC， etal. Recombinant adenovirus-mediated cardiac gene transfer of superoxide dismutase and catalase attenuates postischemic contractile dysfunction.Circulation，1998，98(19 Suppl):II255-260.

［26］Berg K，Wiseth R，Bjerve K， et al. Oxidative stress and myocardial damage during elective percutaneous coronary interventions and coronary angiography.A comparison of bloodborne isoprostane and troponin release.Free Radic Res，2004，38:517-525.

［27］Tsimikas S，Lau HK，Han KR，et al.Percutaneous coronary intervention results in acute increases in oxidized phospholipids and lipoprotein(a):short-term and long-term immunologic responses to oxidized low-density lipoprotein.Circulation，2004，109:3164-3170.

［28］Leite PF，Danilovic A，Moriel P，et al.Sustained decrease in superoxide dismutase activity underlies constrictive remodeling after balloon injury in rabbits.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23:2197-2202.

［29］Daemen J，Wenaweser P，Tsuchida K，et al.Early and late coronary stent thrombosis of sirolimus-eluting and paclitaxeleluting stents in routine clinical practice:data from a large twoinstitutional cohort study.Lancet，2007，369:667-678.

［30］Pfisterer ME.Late stentthrombosisafterdrug-eluting stent implantation for acute myocardial infarction:a new red flag is raised.Circulation，2008，118:1117-1119.