植物類甜蛋白基因家族研究進(jìn)展

姜曉玲，黃秋嫻，李 虹，趙嘉平

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071001；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，北京 100091；3.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院 省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083)

病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)由植物PRs基因編碼，最早從煙草Nicotiana tabacum花葉病毒(tobacco mosaic viru，TMV)侵染的煙草葉片中發(fā)現(xiàn)，依據(jù)氨基酸組成、生物化學(xué)和血清學(xué)特性，將PRs分為17個不同的蛋白家族，即PR-1～PR-17[1]。由于 PR-5蛋白家族的氨基酸序列與西非灌Thaumatococcus daniellii甜蛋白(thaumatin)的氨基酸序列高度同源，因此又被稱為類甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLPs)[2]。研究表明:TLPs與植物的抗逆反應(yīng)有關(guān)，當(dāng)植物受到病原物(真菌、細(xì)菌、病毒等)，化學(xué)因子(乙烯、水楊酸、氨基酸衍生物、重金屬離子等)，物理因子(紫外線、熱處理、機(jī)械損傷等)以及特定的生理因素 (衰老、開花、質(zhì)壁分離等)誘導(dǎo)時，TLPs基因在植物體特定部位迅速表達(dá)并積累。許多研究發(fā)現(xiàn)植物TLPs具有顯著的抗真菌活性，一些轉(zhuǎn)TLPs基因的植物對于真菌性病害的抗性也顯著增強(qiáng)[3]，因而近年來，TLPs的抗真菌功能在植物病理學(xué)研究中受到越來越廣泛的關(guān)注。作為具有較高利用價值的潛在遺傳資源，TLPs基因也在植物抗病育種中展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。筆者將從TLPs基因的起源分布、結(jié)構(gòu)特征、表達(dá)特征和 TLPs的生理功能出發(fā)，分析TLPs基因的研究前景及在植物抗病育種中的應(yīng)用趨勢。

1 類甜蛋白(TLPs)基因的分布、起源及進(jìn)化特征

TLPs分布廣泛，不但存在被子植物、裸子植物和苔蘚植物中，而且存在于線蟲[4]、節(jié)肢動物[5－6]以及真菌[7－8]中。在植物中，TLPs 分布于不同的細(xì)胞或組織中。Léon-Kloosterziel等[9]發(fā)現(xiàn)在無致病性假單胞桿菌的作用下，AtTLP1基因在擬南芥Arabidopsis thaliana根部維管束特異性表達(dá)；而在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，由CKTLP和綠色熒光蛋白構(gòu)成的融合蛋白在細(xì)胞外或細(xì)胞壁上表達(dá)[10]。也有研究表明:一種特定的楊樹TLP1蛋白在有明顯維管系統(tǒng)(例如中脈，葉柄和莖)的組織中表達(dá)，而另一種TLP主要在嫩葉和枝條尖部的淀粉儲藏質(zhì)粒體中表達(dá)[11]。

植物基因組中的TLPs基因以基因家族的形式出現(xiàn)，如模式植物楊樹、擬南芥、水稻Oryza sativa基因組中分別有 55 個[12]、24 個[12]、30 個基因[6]。不同于動物和真菌的單系 TLPs基因類群[13]，系統(tǒng)發(fā)育分析表明植物 TLPs基因家族是一個由10個類群構(gòu)成的復(fù)系類群，這10個類群分別起源于單子葉與雙子葉植物分化之前的10個祖先序列。在植物漫長的進(jìn)化過程中，經(jīng)過染色體復(fù)制、基因復(fù)制、基因轉(zhuǎn)換以及突變最終在不同的植物中形成為數(shù)目不一的基因家族[13－14]。與植物PR1基因家族、β-1，3-葡聚糖酶類似，具有抗微生物活性的TLPs被認(rèn)為是植物天然免疫系統(tǒng)的組成之一[15]，考慮到TLPs基因的古老起源、廣泛分布以及之后在漫長的進(jìn)化歷史中的頻繁發(fā)生基因復(fù)制事件，這些都預(yù)示著TLPs在植物抗逆反應(yīng)中的重要作用，而且研究證明 TLPs基因的適應(yīng)性進(jìn)化過程仍然在持續(xù)[16]，預(yù)期植物尤其是木本植物 TLPs基因家族還會隨著環(huán)境脅迫壓力發(fā)生一定程度的適應(yīng)性進(jìn)化。

2 TLPs的結(jié)構(gòu)特征

TLPs最為重要的結(jié)構(gòu)特征在于其分子中由16個半胱氨酸殘基配對形成的8個二硫鍵，由于這些二硫鍵的存在，使得 TLPs具有了相對穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)，能夠抗熱，抗酶解和抗酸堿[17－19]。一些 TLPs含有N端信號肽，用于引導(dǎo)成熟的蛋白到分泌路徑。逆滲透蛋白(osmotin)和植物OLPs還具有C端前導(dǎo)肽，用于引導(dǎo)蛋白到達(dá)液泡[20]。

TLPs分子的三級結(jié)構(gòu)一般由3個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域Ⅰ由11個β片層(β-sheet)反向平行折疊形成，結(jié)構(gòu)域Ⅱ和結(jié)構(gòu)域Ⅲ主要由α螺旋區(qū)域構(gòu)成[21－23]，而結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ之間形成一個具有強(qiáng)烈電負(fù)性的裂縫(cleft)[23]。然而也有一些特殊的 TLPs，其三級結(jié)構(gòu)只具有結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ，甚至有些TLPs僅僅包含結(jié)構(gòu)域Ⅰ，因此，植物TLPs的分子量大小不等，一般為16～40 kDa，然而不論分子量如何變化，TLPs的氨基酸序列高度同源，并且具有相似的生理學(xué)特征。

3 TLPs的生理功能

3.1 抗真菌活性

抗真菌活性是TLPs的主要功能之一。TLPs參與多種植物病原真菌侵染之后的主動防御反應(yīng)，如水稻紋枯病菌 Rhizocotonia solani的侵染可誘導(dǎo)水稻 TLPs基因表達(dá)，增強(qiáng)它對該病原菌的抗性[24－25]；煙草逆滲透蛋白具有裂解致病疫霉Phytophthora infestans孢子，抑制菌絲生長的功能[26]。牛心樸子Cynanchum komarovii CKTLP對輪枝菌屬Verticillium dahliae，尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum和絲核菌Rhizoctonia solani等真菌生長有抑制[10]。葡萄Vitis vinifera藤TLPs(VvTLP-1)在體外能明顯抑制痂囊腔菌屬 Elsinoe ampelina 孢子的萌發(fā)和菌絲生長[27]。

林木受到病原物侵染之后也有類甜蛋白產(chǎn)生。Zamani等[28]從花旗松Pseudotsuga menziesii中分離了第一個林木類甜蛋白(PmTLP)，Western blot顯示該蛋白在受真菌感染的根部比非感染區(qū)域含量顯著增高，說明該蛋白參與寄主抗真菌防御反應(yīng)。研究還表明:該蛋白可能具有阻止真菌在樹木體內(nèi)進(jìn)一步擴(kuò)展的作用。Piggott等[29]發(fā)現(xiàn)茶藨子生柱銹菌 Cronartium ribicola可誘導(dǎo)西部白皮松類甜蛋白 Pin mTLP在受感染植株干部周圍表達(dá)，Pin mTLP的表達(dá)對松樹皰銹病Cronartium ribicola的發(fā)展有一定抑制作用。

研究表明:植物TLPs主要通過裂解真菌孢子，抑制孢子萌發(fā)，降低幼嫩菌絲活力等方式對致病和非致病真菌產(chǎn)生抑制作用[26，30－33]。并且轉(zhuǎn)TLPs基因植物能夠延緩多種真菌病害發(fā)展過程，如葡萄孢Bostrytis sp.，鐮刀菌 Fusarium sp.，絲核菌 Rhizoctonia sp.，核盤菌Sclerotinia sp.等引起的病害發(fā)展過程，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對病原真菌的抗性[34－38]。

3.2 β-1，3-葡聚糖酶活性

Grenier等[7，39]發(fā)現(xiàn)許多不同來源的 TLPs具有 β-1，3-葡聚糖酶活性。大麥 Hordeum vulgare的 TLPs具有 β-1，3-葡聚糖酶活性，能夠結(jié)合并水解 β-1，3-葡聚糖[39－42]。蘋果 Malus pumila 和櫻桃 Prunus avium中的 TLPs也具有中等的β-1，3-葡聚糖酶活性[42]。Martin等[43]研究顯示:一些發(fā)病的真菌和另外一些絲狀真菌分泌的葡聚糖酶能夠降解真菌細(xì)胞壁。研究發(fā)現(xiàn):煙草 TLPs的β-1，3-葡聚糖酶活性與蛋白質(zhì)分子表面的酸性裂縫中的2個保守的酸性氨基酸殘基有關(guān)[44]。通過蛋白質(zhì)建模以及功能分析，筆者發(fā)現(xiàn):部分楊樹TLPs中也有保守性的Glu92-Asp110氨基酸殘基存在，并且這2個殘基中的活性氧原子處于催化活性發(fā)揮的正確位置，因此，認(rèn)為部分楊樹 TLPs也具有β-1，3-葡聚糖酶活性[9]。研究表明:這個結(jié)構(gòu)與TLPs的生理功能有密切聯(lián)系。

然而，相對與真正的β-1，3-葡聚糖酶催化位點(diǎn)之間的較短距離[45]，楊樹，玉米Zea mays，草莓Fragaria ananassa等 TLPs分子的催化位點(diǎn)之間較長的距離[16]，可能解釋了 TLPs的β-1，3-葡聚糖酶活性較低的事實(shí)，因此，Menu-Bouaouiche等[42]認(rèn)為，僅僅TLPs本身可能無法直接通過破壞真菌細(xì)胞壁，而是通過β-1，3-葡聚糖酶反應(yīng)的產(chǎn)物來誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)進(jìn)而抵抗真菌的侵染。

3.3 其他活性

除了抗真菌活性和β-1，3-葡聚糖酶活性外，許多研究還發(fā)現(xiàn) TLPs具有酶抑制劑活性。來自玉米的抗真菌蛋白(zeamatin)是較早被鑒定出的具有淀粉酶抑制劑活性的 TLPs[30，46]?？拐婢鞍淄ㄟ^抑制昆蟲淀粉酶活性，阻礙昆蟲消化吸收食物中的碳水化合物,減少糖分?jǐn)z取，造成昆蟲營養(yǎng)不良和能量不足，進(jìn)而導(dǎo)致昆蟲死亡。因此，F(xiàn)ranco等[47]建議利用具有а-淀粉酶抑制劑活性的 TLPs來控制象鼻蟲(weevils)等以淀粉為主要食物的有害生物。

一些植物果實(shí)和花粉中的TLPs具有植物過敏原活性。第一個被鑒定出具有過敏原活性的 TLPs是來自蘋果的 Mal d 2[48]。并且 Krebitz等[49]發(fā)現(xiàn)重組的煙草花葉病毒在煙草中表達(dá)的 Mal d 2也具有過敏原活性。繼 Mal d 2 之后，又從甜椒 Capsicum annuum[50]，櫻桃 Prunus arium[51]，獼猴桃 Actinidia sp.[52]，葡萄[53]和 香蕉Musa supientum[54]的果肉中分離出具有過敏原活性的 TLPs。由于果實(shí)中含有大量水分和甜味物質(zhì)，很容易被真菌或昆蟲侵襲，因此，Hoffmann-Sommergruber[55]認(rèn)為:組成型表達(dá)于特定發(fā)育階段的 TLPs可以對果實(shí)起到快速保護(hù)作用。也有研究者從杜松Juniperus ashei[56]，綠干柏Cupressus arizonica[57]和日本柳杉 Cryptomeria japonica[58]的花粉中分離出具有過敏原活性的 TLPs Jun a 3，Cup a 3，Cry j 3。此外，引起人類過敏癥的過敏原中也包括TLPs，Palacín等[59]在研究中發(fā)現(xiàn)桃子Prunus persica中的3種 TLPs是桃的首要過敏原。Lehto等[60]發(fā)現(xiàn)小麥中的 TLPs是與面包房哮喘相關(guān)的最新的過敏原。筆者發(fā)現(xiàn):部分楊樹 TLPs具有過敏原活性，并且這些TLPs多數(shù)在美洲黑楊及青楊花粉中表達(dá)(待發(fā)表)。因此，春季楊樹花粉中特定TLPs基因的表達(dá)可能是造成部分人群過敏的原因之一，然而過敏原活性對于楊樹、松樹等的生理意義仍是值得深入探討的問題。

一些研究者發(fā)現(xiàn):植物 TLPs還具有抗凍活性,木聚糖酶抑制劑活性和抗蟲活性。Hon等[61]通過氨基末端序列比較，免疫交叉反應(yīng)和酶活性分析，在冬黑麥Secale cereale的葉片質(zhì)外體中分離出2個具有抗凍活性的 TLPs(25 kDa和16 kDa)；最近的研究發(fā)現(xiàn)一種來自小麥的新型木聚糖酶抑制劑(TLX1)屬于TLP家族，重組的TLX1蛋白對長枝木霉Trichoderma longibrachiatum木聚糖酶XynI有抑制活性[62]；新近研究表明:被麥二叉蚜Schizaphis graminum取食后，高粱Sorghum vulgare TLPs基因上調(diào)表達(dá)，因此，證明TLPs與植物抵御昆蟲反應(yīng)有關(guān)[63]。

4 TLPs的抗真菌機(jī)制

雖然已有很多關(guān)于TLPs抗真菌活性的報道，但是植物TLPs抗真菌病害的詳細(xì)分子機(jī)制還不明確。由于玉米類甜蛋白抗真菌蛋白可以導(dǎo)致鏈孢霉Neurospora crassa細(xì)胞的快速裂解，而煙草逆滲透蛋白也能夠?qū)е掳咨钪榫鶦andida albicans細(xì)胞內(nèi)容物迅速外溢而致死。因此，早期研究認(rèn)為:植物TLPs促使真菌細(xì)胞膜形成小孔，從而使水流入，進(jìn)而引起細(xì)胞滲透破裂，來達(dá)到抗菌目的[20，26]。然而，結(jié)構(gòu)分析表明: 抗真菌蛋白和逆滲透蛋白并不具有導(dǎo)致細(xì)胞膜孔洞形成的特征[26，33]。

Menu-Bouaouiche等[42]認(rèn)為: TLPs結(jié)構(gòu)域Ⅰ和結(jié)構(gòu)域Ⅱ之間的酸性裂縫與抗真菌活性有關(guān)[64－66]。然而，Chan等[67]發(fā)現(xiàn)冬黑麥Secale cereale中的 TLPs只具有結(jié)構(gòu)域Ⅰ中的酸性殘基，沒有裂縫結(jié)構(gòu)，也具有抗真菌活性。所以，他們認(rèn)為TLPs結(jié)構(gòu)域Ⅰ中的酸性殘基與真菌細(xì)胞膜上的水通道蛋白、離子通道蛋白和滲透感受器之間的相互作用，使得TLPs具有了抗真菌活性。通過適應(yīng)性進(jìn)化和蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析，Zhao和 Su[16]進(jìn)一步證明了楊樹 TLPs分子表面酸性裂縫與抗真菌活性之間的相關(guān)性。

另外，TLPs的裂縫區(qū)域是一個典型的碳水化合物的結(jié)合位點(diǎn)，Osmond等[40]用實(shí)驗(yàn)證明 TLPs與線性β-1，3-葡聚糖的結(jié)合發(fā)生于裂縫區(qū)域，裂縫區(qū)域內(nèi)的幾個殘基與真菌細(xì)胞壁的碳水化合物形成氫鍵，并且芳香族氨基酸在裂縫處參與形成堆積力共同破壞了真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，使TLPs與細(xì)胞膜接觸，造成真菌細(xì)胞死亡。改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)是 TLPs抑制真菌侵染的先決條件。TLPs除了與細(xì)胞壁上的 β-1，3-葡聚糖特異性結(jié)合改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)外，還可以通過其他的途徑改變細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。煙草逆滲透蛋白能夠誘導(dǎo)酵母有絲分裂過程中的促細(xì)胞分裂原活化蛋白激酶(MAP-kinase)的表達(dá)，通過改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使逆滲透蛋白能夠與細(xì)胞膜接觸而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[68]。

TLPs的抗真菌機(jī)制不僅與真菌細(xì)胞壁破壞和真菌細(xì)胞膜透性改變有關(guān)之外，還與木質(zhì)素，植保素等抗性物質(zhì)的合成以及抗性結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)，植物TLPs表現(xiàn)的抗真菌活性很可能是與這些防御機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果。

5 TLPs基因的表達(dá)

TLPs基因一般在植物特定組織、器官中低水平組成型表達(dá)，而且表達(dá)活性不同。如草莓TLPs基因在葉和花冠中表達(dá)量最多，在根中表達(dá)量中等，在未成熟果實(shí)中表達(dá)量最少[69]。受到外界逆境脅迫后，TLPs基因的表達(dá)可以迅速上調(diào)。研究表明:被麥二叉蚜取食的高粱中TLPs基因的轉(zhuǎn)錄增加幾千倍[63]。草莓Fragaria ananassa受到脫落酸脅迫6 h后，體內(nèi)TLPs表達(dá)量為最初表達(dá)量的8.8倍；受水楊酸脅迫48 h后，TLPs基因表達(dá)量為最初的30.5倍；而機(jī)械損傷可以誘導(dǎo)其 TLPs表達(dá)量增加7.8倍[69]。

TLPs基因的表達(dá)與植物生長環(huán)境(生長狀態(tài))和植物抗病性有關(guān)。植物生長狀態(tài)方面，如雪松Cedrus deodara花粉中具有過敏原活性的 TLPs在不同年份的含量差別高達(dá)5.0倍以上[70]。大麥和燕麥Avena sativa從子房壁發(fā)育到糊粉層的過程中，TLPs基因的表達(dá)發(fā)生了改變[71]。一種胡椒TLP基因也是在果實(shí)成長過程中表達(dá)[72]。一種葡萄糖甘酸酶啟動子聚變(融合)研究發(fā)現(xiàn)日本梨Pyrus serotina的TLP基因(PsTL1)特定的在雌蕊和花藥中低水平表達(dá)，但是在其他花器官和葉子中沒有表達(dá)[73]。植物抗病性方面，小麥冠腐病菌Fusarium pseudograminearum侵染4 d后，小麥抗病品種中TLPs基因表達(dá)顯著高于感病品種[74]。林木中，Petre等[13]最近發(fā)現(xiàn)楊樹TLPs基因的表達(dá)可能與楊樹對于楊柵銹菌Melampsora sp.的抗性有關(guān)。然而，也有一些TLPs基因?qū)Σ≡{迫不敏感，而在植物受到生理、化學(xué)或物理因素誘導(dǎo)時大量表達(dá)。例如:有些 TLPs基因只有在植物的某些發(fā)育階段的特定器官，如檢測到 Ban-TLP，Mal-TLP和Pru-TLP在香蕉、蘋果以及梨的果實(shí)中高量表達(dá)[42]。

最新研究顯示:在TLPs基因表達(dá)受啟動子調(diào)控。啟動子中的沉默子會抑制防御反應(yīng)中生姜Zingiber officinale TLPs(ZoPR5)的表達(dá)。啟動子中的GT-1 box和TGTCA可以激活植物防御反應(yīng)中林亡果姜Curcuma amada TLPs(CaPR5)的表達(dá)[75]。

進(jìn)一步分析研究表明: TLPs基因家族的特定成員在特定條件下的表達(dá)模式并不相同。筆者的研究表明:室溫光照培養(yǎng)條件下，楊樹TLPs基因的55個成員中，有37個基因至少在根、成熟皮、嫩皮、成熟葉、嫩葉5個部位中的1個部位表達(dá)，而僅有4個基因在全部5個部位同時表達(dá)，并且這些表達(dá)的基因分布在除類群9之外的9個不同的系統(tǒng)發(fā)育類群中；同時初步研究表明:類群5及類群6中的多數(shù)TLPs基因的表達(dá)與真菌侵染存在相關(guān)性(未發(fā)表)，考慮到系統(tǒng)發(fā)育特征，因此以往研究中 TLPs基因的復(fù)雜多樣的表達(dá)特征以及功能特征可能是 TLPs基因家族不同成員的特征的集合，對于植物 TLPs基因的功能需要在全基因組水平上進(jìn)行細(xì)致的研究，目前，楊樹 TLPs基因的差異表達(dá)模式及TLPs基因家族不同成員的功能驗(yàn)證工作正在進(jìn)行中。

6 TLPs基因在植物抗病育種方面的應(yīng)用

由于具有有效的抗真菌作用，TLPs基因現(xiàn)已被應(yīng)用到多種作物的抗真菌基因工程中，并且取得了理想的效果。Kuwabara等[76]克隆了冬小麥taTLPs基因，其表達(dá)蛋白在低溫下能夠抑制小麥雪霉葉枯病菌Microdochium nivale菌絲的生長，增強(qiáng)冬小麥的雪霉病抗性。研究顯示:小麥TLPs基因的表達(dá)可以減輕由Fusarum pseudograminearum導(dǎo)致的小麥冠腐病癥狀[74]。另外，將水稻TLP基因轉(zhuǎn)入小麥中，可增強(qiáng)小麥對小麥禾谷鐮刀菌F.graminearum的抗性[35]。超量表達(dá)的CKTLP明顯的提高了擬南芥對輪枝菌Verticillium dahliae 的抗性[10]。

組成型表達(dá)逆滲透蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草對交鏈孢菌Alternaria sp.的抗性得到明顯增強(qiáng)[77]。轉(zhuǎn)逆滲透蛋白基因的馬鈴薯Solanum tuberosum，晚疫病癥狀減輕，抗病性得到增強(qiáng)[37]；超量表達(dá)類似逆滲透蛋白(osmotin-like)的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯對致病疫霉的抗性增強(qiáng)[3]。

組成型表達(dá)TLPs的轉(zhuǎn)基因水稻抗真菌能力明顯增強(qiáng)[78]；在秈稻優(yōu)良品種中超量表達(dá)水稻TLPs基因增強(qiáng)了其對水稻紋枯病致病菌 Rhizoctonia solani和水稻葉鞘腐敗病菌Sarocladium oryzae的抗性[79]。將水稻 TLPD34導(dǎo)入匍匐剪股穎 Agrostis palustris中，能夠增強(qiáng)其對幣斑病菌 Sclerotinia homoeocarpa的抗性[25]。重組龍葵 Solanum nigrum TLPs(SnOLP)在體外對 Fusarium solani f.sp.glycines，Colletotrichum spp.，Macrophomina phaseolina和Phytophthora nicotiana var.parasitic等植物病原真菌的生長均具有抑制活性[80]。TLPs基因已經(jīng)在多種植物中成功表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植物顯示的對于多種病原真菌的抗性揭示培育轉(zhuǎn)TLPs基因植物將是植物抗病育種的有效途徑之一，然而在林木TLPs基因的遺傳轉(zhuǎn)化仍未見報道。

7 問題與展望

對于植物TLPs基因家族，雖然在其結(jié)構(gòu)，生理功能等方面已經(jīng)有了大量的研究，在植物轉(zhuǎn)基因抗病育種中也有了一些較為成功的應(yīng)用實(shí)例，但在 TLPs的功能、TLPs誘導(dǎo)植物抗性的信號傳遞、與TLPs基因有關(guān)的多基因聚合育種等方面仍有許多問題有待深入探討。首先，如前所述，雖然TLPs是與抗真菌有關(guān)的許多特性已經(jīng)得到證明，但是TLPs抗真菌活性的核心機(jī)理有待進(jìn)一步闡明，而這將會對TLPs分子功能的定向設(shè)計奠定基礎(chǔ)，從而有利于TLPs抗真菌功能的進(jìn)一步發(fā)揮。其次，植物TLPs基因家族是由10個具有共同起源的旁系類群構(gòu)成，不同類群內(nèi)的 TLPs基因高度分化，而已經(jīng)報道的TLPs基因多數(shù)屬于類群5和類群6，其他類群的 TLPs是否具有相近的功能，或者說TLPs的不同分支是否對應(yīng)于不同的生理功能，這仍然是一個需要深入研究的課題。第三，研究發(fā)現(xiàn):在不同的條件下，植物特定 TLPs基因的表達(dá)分別與茉莉酸(JA)，乙烯(ET)及水楊酸(SA)信號傳導(dǎo)途徑有關(guān)，而病原菌脅迫過程中，茉莉酸以及 水楊酸信號傳導(dǎo)途徑分別與酸性以及堿性 PR蛋白有關(guān)[81]，然而具體到TLPs基因家族，誘導(dǎo)酸性、堿性TLPs產(chǎn)生的信號傳導(dǎo)機(jī)制仍然不明確。對于以上問題的探索，將會有助于對外來生物或非生物脅迫出現(xiàn)時，植物天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮免疫作用細(xì)節(jié)的了解。第四，基于TLPs基因家族的功能特性，顯而易見，通過研究真菌病害過程中TLPs基因的表達(dá)特征，探討TLPs與林木抗病性之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)有效地林木抗病性相關(guān)TLPs基因并實(shí)現(xiàn)遺傳轉(zhuǎn)化，將是當(dāng)今林木病理學(xué)和遺傳育種研究中的重要內(nèi)容之一。另外，由于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多TLPs與人體的過敏反應(yīng)有關(guān)，因此，林木，尤其對于在中國具有廣泛栽植面積的楊樹、松樹所引起的過敏性疾病的防治不僅是一個亟待解決的公共衛(wèi)生課題，也是林木遺傳育種研究中需要引起關(guān)注的重要問題。

[1]van LOON L C，van STRIEN E A.The families of pathogenesis-related proteins，their activities，and comparative analysis of PR-1 proteins [J].Physiol Mol Plant Pathol，1999，55: 85－97.

[2]van LOON L C，PIERPOINT W S，BOLLER T，et al.Recommendations for naming plant pathogenesis-related proteins [J].Plant MolBiol Rep，1994，12 (3): 245-264.

[3]ZHU Baolong，CHEN T H H，LI P H.Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for an osmotin-like protein [J].Planta，1996，198: 70-77.

[4]KITAJIMA S，SATO F.Plant pathogenesis-related proteins:molecular mechanisms of gene expression and protein function [J].J Biochem，1999，125 (1): 1-8.

[5]BRANDAZZA A，ANGELI S，TEGONI M，et al.Plant stress proteins of the thaumatin-like family discovered in animals [J].FEBS Lett，2004，572 (1/3 ): 3-7.

[6]SHATTERS R G Jr，BOYKIN L M，LAPOINTE S L，et al.Phylogenetic and structural relationships of the PR-5 gene family reveal an ancient multigene family conserved in plants and select animal taxa [J].J Mol Evol，2006，63 (1):12-29.

[7]GRENIER J，POTVIN C，ASSELIN A.Some fungi express β-1，3-glucanases similar to thaumatin-like proteins [J].Mycologia，2000，92 (5): 841-848.

[8]SAKAMOTO Y，WATANABE H，NAGAI M，et al.Lentinula edodes tlg1 encodes a thaumatin-like protein that is involved in lentinan degradation and fruiting body senescence [J].Plant Physiol，2006，141: 793-801.

[9]LéON-KLOOSTERZIEL K M，VERHAGEN B W M，KEURENTJES J J B，et al.Colonization of the Arabidopsis rhizosphere by fluorescent Pseudomonas spp.activates a root-specific，ethylene-responsive PR-5 gene in the vascular bundle [J].Plant Mol Biol，2005，57: 731-748.

[10]WANG Qinghua，LI Fuguang，ZHANG Xue，et al.Purification and characterization of a CKTLP protein from Cynanchum komarovii seeds that confers antifungal activity [J].PLoS One，2011，6 (2): e16930.doi: 10.1371/journal.pone.0016930.

[11]DAFOE N J，GOWEN B E，CONSTABEL C P.Thaumatin-like proteins are differentially expressed and localized in phloem tissues of hybrid poplar [J].BMC Plant Biol，2010，10: 191.

[12]TUSKAN G A，DIFAZIO S，JANSSON S，et al.The genome of black cottonwood，Populus trichocarpa (Torr.＆ Gray)[J].Science，2006，313 (5793): 1596-1604.

[13]BENJAMIN P，IAN M，NICOLAS R，et al.Genome-wide analysis of eukaryote thaumatin-like proteins(TLPs) with an emphasis on poplar [J].BMC Plant Biol，2011，11: 33.

[14]SHATTERS R G Jr，BOYKIN L M，LAPOINTE S L，et al.Phylogenetic and structural relationships of the pr5 gene family reveal an ancient multigene family conserved in plants and select animal taxa [J].J Mol Evol，2006，63(1): 12-29.

[15]BORREGAARD N，ELSBACH P，GANZ T，et al.Innate immunity: from plants to humans [J].Immunol，Today，2000，21 (1): 68-70.

[16]ZHAO Jiaping，SU Xiaohua.Patterns of molecular evolution and predicted function in thaumatin-like proteins of Populus trichocarpa [J].Planta，2010，232 (4): 949-962.

[17]VELAZHAHAN R，DATTA S K，MUTHUKRISHNAN S.The PR-5 family: thaumatin-like proteins[G]//DATTA S K，MUTHUKRISHNAN S.Pathogenesis-Related Proteins in Plants.Boca Raton: CRC Press，1999: 118-140.

[18]SMOLE U，BUBLIN M，RADAUER C，et al.Mal d 2，the thaumatin-like allergen from apple，is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing [J].Int Arch Allergy Immunol，2008，147 (4): 289-298.

[19]FIERENS E，GEBRUERS K，VOET A R D，et al.Biochemical and structural characterization of TLXI，the Triticum aestivum L.thaumatin-like xylanase inhibitor[J].J Enzyme Inhib Med Chem，2009，24 (4): 646-654.

[21]OGATA C M，GORDON P F，de VOS AM，et al.Crystal structure of a sweet tasting protein thaumatin I，at 1.65 A resolution [J].J Mol Biol，1992，228: 893-908.

[22]BATALIA M A，MONZINGO A F，ERNST S，et al.The crystal structure of the antifungal protein zeamatin，a member of the thaumatin-like，PR-5 protein family [J].Nat Struct Biol，1996，3: 19-23.

[23]GHOSH R，CHAKRABARTI C.Crystal structure analysis of NP24-I: a thaumatin-like protein [J].Planta，2008，228(5): 883-890.

[24]VELAZHAHAN R，CHENCOLE K，ANURATHA C S，et al.Induction of thaumatin-like protein (TLPs) in Rhizoctonia solani-infected rice and characterization of two new cDNA clones [J].Physiol Plantarum，1998，102: 21-28.

[25]FU Daolin，TISSERAT N A，XIAO Yanmei，et al.Over expression of a rice TLPD34 enhances dollar-spot resistance in transgenic bent grass [J].Plant Sci，2005，168 (3): 671-680.

[26]ABAD L R，D′URZO M P，LIU Dong，et al.Antifungal activity of tobacco osmotin has specificity and involves plasma membrane permeabilization [J].Plant Sci，1996，118 (1): 11-23.

[27]JAYASANKAR S，LI Zhijian，GRAY D J.Constitutive expression of Vitis vinifera thaumatin-like protein after in vitro selection and its role in anthracnose resistance [J].Funct Plant Biol，2003，30 (11): 1105-1115.

[28]ZAMANI A，STURROCK R N，EKRAMODDOULLAH A K，et al.Gene cloning and tissue expression analysis of a PR-5 thaumatin-like protein in Phellinus weirii-infected Douglas-fir[J].Biochem Cell Biol，94 (11): 1235-1243.

[29]PIGGOTT N，EKRAMODDOULLAH A K M，LIU Junjun，et al.Gene cloning of a thaumatin-like(PR-5)protein of western white pine (Pinus monticola D.Don) and expression studies of members of the PR-5 group [J].Physiol Mol Plant Pathol，2004，64 (1): 1-8.

[30]ROBERTS W K，SELITRENNIKOFF C P.Zeamatin，an antifungal protein from maize with membrane-permeabilizing activity [J].Microbiology，1990，136 (9): 1771-1778.

[31]WOLOSHUK C P，MEULENHOFF J S，SELA-BUURLAGE M，et al.Pathogen-induced proteins with inhibitory activity toward Phytopthora infestans [J].Plant Cell，1991，3 (6): 619-628.

[32]HU Xu，REDDY A S N.Cloning and expression of a PR5-like protein from Arabidopsis: inhibition of fungal growth by bacterially expressed protein [J].Plant Mol Biol，1997，34 (6): 949-959.

[33]KOIWA H，KATO H，NAKATSU T，et al.Purification and characterization of tobacco pathogenesis-related protein PR-5d，an antifungal thaumatin-like protein [J].Plant Cell Physiol，1997，38 (7): 783-791.

[34]PUNJA Z K.Genetic engineering of plants to enhance resistance to fungal pathogens-a review of progress and future prospects [J].Can J Plant Pathol，2001，23: 216-235.

[35]CHEN W P，CHEN P D，LIU D J，et al.Development of wheat scab symptoms is delayed in transgenic wheat plants that constitutively express a rice thaumatin-like protein gene [J].Theor Appl Genet，1999，99 (5): 755-760.

[36]DATTA K，VELAZHAHAN R，OLIVA N，et al.Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5)gene in transgenic rice plants enhances environmentally friendly resistance to Rhizoctonia solani causing sheath blight disease [J].Theor Appl Genet，98: 1138-1145.

[37]LIU Dong，RAGHOTHAMA K G，HASEGAWA P M，et al.Osmotin over expression in potato delays development of disease symptoms [J].Proc Natl Acad Sci USA，1994，91 (5): 1888-1892.

[38]LIU Dong，RHODES D，D’URZO M P，et al.In vivo and in vitro activity of truncated osmotin that is secreted into the extracellular matrix [J].Plant Sci，1996，121 (2): 123-131.

[39]GRENIER J，POTVIN C，TRUDEL J，et al.Some thaumatin-like proteins hydrolyze polymeric β-1，3-glucans [J].Plant J，1999，19 (4): 473-480.

[40]OSMOND R I，HRMOVA M，F(xiàn)ONTAINE F，et al.Binding interactions between barley thaumatin-like proteins and(1，3)-β-D-glucans: kinetics，specificity，structural analysis and biological implications [J].Euro J Biochem，2001，268 (15): 4190-4199.

[41]TRUDEL J，GRENIER J，POTVIN C，et al.Several thaumatin-like proteins bind to β-1，3-glucans [J].Plant Physiol，1998，118 (4): 1431-1438.

[42]MENU-BOUAOUICHE L，VRIET C，PEUMANS W J，et al.A molecular basis for the endo-β-1，3-glucanase activity of the thaumatin-like proteins from edible fruits [J].Biochimie，2003，85 (1/2): 123-131.

[43]MARTIN K，McDOUGALL B M，MCILROY S，et al.Biochemistry and molecular biology of exocellular fungal β-(1，3)-and β-(1，6)-glucanases [J].FEMS Microbiol Rev，2007，31 (2): 168-192.

[44]GHOSH R，CHAKRABARTI C.Crystal structure analysis of NP24-I: a thaumatin-like protein [J].Planta，2008，228(5): 883-890.

[45]ZECHEL D L，WITHERS S G.Dissection of nucleophilic and acid-base catalysis in glycosidases [J].Curr Opin Chem Biol，2001，5 (6): 643-649.

[46]SCHIMOLER-óROURKE R，RICHARDSON M，SELITRENNIKOFF C P.Zeamatin inhibits trypsin and alpha-amylase activities [J].Appl Environ Microbiol，2001，67 (5): 2365-2366.

[47]FRANCO O L，RIGDEN D J，MELO F R.Plant α-amylase inhibitors and their interaction with insect α-amylases[J].Eur J Biochem，2002，269 (2): 397-412.

[48]HSIEH L S，MOOS M Jr，LI Yuan.Characterization of apple 18 and 31 kd allergens by microsequencing and evaluation of their content during storage and ripening [J].J Allergy Clin Immunol，1995，96 (6): 960-970.

[49]KREBITZ M，WAGNER B，F(xiàn)ERREIRA F，et al.Plant-based heterologous expression of mal d 2，a thaumatin-like protein and allergen of apple (Malus domestica)，and its characterization as an antifungal protein [J].J Mol Biol，2003，329 (4): 721-730.

[50]JENSEN-JAROLIM E，SANTNER B，LEITNER A，et al.Bell peppers(Capsicum annuum)express allergens(profilin，pathogenesis-related protein P23 and bet v 1) depending on the horticultural strain [J].Int Arch Allergy Immunol，1998，116 (2): 103-109.

[51]INSCHLAG C，HOFFMANN-SOMMERGRUBER K，O'RIORDAIN G，et al.Biochemical characterization of Pru a 2，a 23-kD thaumatin-like protein representing a potential major allergen in cherry (Prunus avium) [J].Int Arch Allergy Immunol，1998，116 (1): 22-28.

[52]GAVROVI?-JANKULOVI? M，?IRKOVI? T，VU?KOVI? O，et al.Isolation and biochemical characterization of a thaumatin-like kiwi allergen [J].J Allergy Clin Immunol，2002，110 (5): 805-810.

[53]PASTORELLO E A，F(xiàn)ARIOLI L，PRAVETTONI V，et al.Identification of grape and wine allergens as an endochitinase 4，a lipid-transfer protein，and a Thaumatin [J].J Allergy Clin Immunol，2003，111 (2): 350-359.

[54]LEONE P，MENU-BOUAOUICHE L，PEUMANS W J，et al.Resolution of the structure of the allergenic and antifungal banana fruit thaumatinlike protein at 1.7-A [J].Biochimie，2006，88: 45-52.

[55]HOFFMANN-SOMMERGRUBER K.Plant allergens and pathogenesis-related proteins [J].Int Arch Allergy Immunol，2000，122 (3): 155-166.

[56]MIDORO-HORIUTI T，GOLDBLUM R M，KUROSKY A，et al.Variable expression of pathogenesis-related protein allergen in mountain cedar (Juniperus ashei) pollen [J].J Immunol，2000，164 (4): 2188-2192.

[57]CORTEGANO I，CIVANTOS E，ACEITUNO E，et al.Cloning and expression of a major allergen from Cupressus arizonica pollen，cup a 3，a PR-5 protein expressed under polluted environment [J].Allergy，2004，59 (5): 485-490.

[58]FUJIMURA T，F(xiàn)UTAMURA N，MIDORO-HORIUTI T，et al.Isolation and characterization of native cry j 3 from Japanese cedar(Cryptomeria japonica) pollen [J].Allergy，2007，62 (5): 547-553.

[59]PALACíN A，TORDESILLAS L，GAMBOA P，et al.Characterization of peach thaumatin-like proteins and their identification as major peach allergens [J].Clin ＆ Exp Allergy，2010，40 (9): 1422-1430.

[60]LEHTO M，AIRAKSINEN L，PUUSTINEN A，et al.Thaumatin-like protein and baker’s respiratory allergy [J].Ann Allergy Asthma ＆ Immunol，2010，104 (2): 139-146.

[61]HON W C，GRIFFITH M，MLYNARZ A，et al.Antifreeze proteins in winter rye are similar to pathogenesis-related proteins [J].Plant Physiol，1995，109 (3): 879-889.

[62]FIERENS E，ROMBOUTS S，GEBRUERS K，et al.TLXI，a novel type of xylanase inhibitor from wheat(Triticum aestivum) belonging to the thaumatin family [J].Biochem J，2007，403: 583-591.

[63]CHOU Juan，HUANG Yinghua.Differential expression of thaumatin-like proteins in sorghum infested with greenbugs[J].Z Naturforsch，2010 ，65 (3/4): 271-276.

[64]BATALIA M A，MONZINGO A F，ERNST S，et al.The crystal structure of the antifungal protein zeamatin，a member of the thaumatin-like，PR-5 protein family [J].Nat Struct ＆ Mol Biol，1996，3: 19-23.

[65]KOIWA H，KATO H，NAKATSU T，et al.Crystal structure of tobacco PR-5d protein at 1.8 A°resolution reveals a conserved acidic cleft structure in antifungal thaumatin-like proteins [J].J Mol Biol，1999，286: 1137-1145.

[66]MIN K，HA S C，HASEGAWA P M，et al.Crystal structure of osmotin，a plant antifungal protein [J].Proteins Struct Funct Bioinform，2004，54: 170-173.

[67]CHAN Y W，TUNG W L，GRIFFITH M，et al.Cloning of a cDNA encoding the thaumatin-like protein of winter rye (Secale cereale L.Musketeer) and its functional characterization [J].J Exp Bot，1999，50 (339): 1627-1628.

[68]YUN D J，ZHAO Y，PARDO J M，et al.Stress proteins on the yeast cell surface determine resistance to osmotin，a plant antifungal protein [J].PNAS，1997，94 (13): 7082-7087.

[69]ZHANG Yuhua，SHIH D S.Isolation of an osmotin-like protein gene from strawberry and analysis of the response of this gene to abiotic stresses [J].J Pant Physiol，2007，164 (1): 68-77.

[70]MIDORO-HORIUTI T，GOLDBLUM R M.，KUROSKY A，et al.Variable expression of pathogenesis-related protein allergen in mountain cedar (Juniperus ashei) pollen [J].J Immunol，2000，164 (4): 2188-2192.

[71]SKADSEN R W，SATHISH P，KAEPPLER H F.Expression of thaumatin-like permatin PR-5 genes switches from the ovary wall to the aleurone in developing barley and oat seeds [J].Plant Sci，2000，156 (1): 11-22.

[72]KIM Y S，PARK J Y，KIM K S，et al.A thaumatin-like gene in nonclimacteric pepper fruits used as molecular marker in probing disease resistance，ripening，and sugar accumulation [J].Plant Mol Biol，2002，49 (2): 125-135.

[73]SASSA H，USHIJIMA K，HIRANO H.A pistil-specific thaumatin/PR5-like protein gene of Japanese pear(Pyrus serotina): sequence and promoter activity of the 50 region in transgenic tobacco [J].Plant Mol Biol，2002，50 (3):371-377.

[74]DESMONDOJ O J，EDGAR C I，MANNERS J M，et al.Methyl jasmonate induced gene expression in wheat delays symptom development by the crown rot pathogen Fusarium pseudograminearum [J].Physiol Mol Plant Pathol，2006，67(3/5): 171-179.

[75]PRASATH D，EL-SHARKAWY I，SHERIF S，et al.Cloning and characterization of PR-5 gene from Curcuma amada and Zingiber officinale in response to Ralstonia solanacearum infection [J/OL].Plant Cell Rep.2011-05-19 [2011-05-28].http: //www.springerlink.com/content/7pnr204736343np2/fulltext.pdf.

[76]KUWABARA C ，TAKEZAWA D，SHIMADA D，et al.Abscisic acid-and cold-induced thaumatin-like protein in winter wheat has an antifungal activity against snow mould，Microdochium nivale [J].Physiol Plantarum，2002，115(1): 101-110.

[77]VELAZHAHAN R，MUTHUKRISHNAN S.Transgenic tobacco plants constitutively overexpressing a rice thaumatinlike protein (PR-5) show enhanced resistance to Alternaria alternata [J].Biol Plant，2003，47 (3): 347-354.

[78]DATTA K，VELAZHAHAN R，OLIVA N，et al.Over-expression of the cloned rice thaumatin-like protein (PR-5)gene in transgenic rice plants enhances environmentally friendly resistance to Rhizoctonia solani causing sheath blight disease [J].Theor Appl Genet，1999，98: 1138-1145.

[79]KALPANA K，MARUTHASALAM S，RAJESH T，et al.Engineering sheath blight resistance in elite indica rice cultivars using genes encoding defense proteins [J].Plant Sci，2006，170 (2): 203-215.

[80]CAMPOS M A，SILVA M S，MAGALHES C P，et al.Expression in Escherichia coli，purification，refolding and antifungal activity of an osmotin from Solanum nigrum [J].Microbial Cell Factories，2008，7: 1-7.

[81]KUNKEL B N，BROOKS D M.Cross talk between signaling pathways in pathogen defense [J].Curr Opin Plant Biol，2002，5 (4): 325-331.