線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔與老年心肌的研究進(jìn)展

孫燕華，吉冰洋

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院,阜外心血管病醫(yī)院體外循環(huán)科,北京 100037）

隨著人口的老齡化急速發(fā)展，心血管疾病已成為老年人群最致命的殺手。目前研究證實(shí)，年齡是心血管相關(guān)疾病發(fā)病率和死亡率升高的一個(gè)主要的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在人體衰老過程中，心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能均會(huì)產(chǎn)生一系列變化，并且老年心肌細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出對缺血缺氧等心血管應(yīng)激事件更強(qiáng)的敏感性和較差的耐受性。在心肌衰老過程中，線粒體作為對各種損傷最為敏感的細(xì)胞器之一，近年來備受關(guān)注。線粒體是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要場所，是為細(xì)胞活動(dòng)提供能量的源泉。線粒體結(jié)構(gòu)、功能的損傷程度既是衡量心肌細(xì)胞受損的指標(biāo)，又是細(xì)胞死亡調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，對線粒體結(jié)構(gòu)和功能的保護(hù)，是優(yōu)化心肌保護(hù)策略、提升老年人心血管疾病診療水平的重要途徑。存在于線粒體膜上的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）是一種非選擇性通道，它的啟閉影響著線粒體結(jié)構(gòu)功能損傷，乃至細(xì)胞壞死、凋亡。近年來的大量研究表明，mPTP開放的調(diào)節(jié)在老年心肌細(xì)胞中具有一定的特殊性，而它的開放也對心肌細(xì)胞的衰老進(jìn)程起到非常重要的作用。

1 mPTP結(jié)構(gòu)及開放

目前，mPTP的結(jié)構(gòu)尚未完全確定，較經(jīng)典的模型包括如下組分：線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）、內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（adenine nucleotide translocase，ANT）、基質(zhì)的親環(huán)蛋白D（cyclophilin D，CyP-D）及一些其他調(diào)控蛋白，如Bax[1]，外周苯二氮卓受體（peripheral benzodiazepine receptor，PBR），己糖激酶（hexokinase，HK）和肌酸激酶（creatine kinase，CK）。在線粒體基質(zhì)游離鈣離子的激發(fā)下，CyP-D與ANT的結(jié)合會(huì)開放mPTP，而這又會(huì)反過來增加 mPTP 對鈣的敏感性[2]。然而，ANT或VDAC缺失的線粒體，其mPTP仍可被誘導(dǎo)開放[3,4]，這提示ANT和VDAC并非mPTP開放所必需的，只是可以調(diào)控對誘導(dǎo)mPTP開放因素的敏感性[5]。另有研究指出，線粒體磷酸鹽載體（phosphate carrier，PiC）可能也是mPTP的重要組分,并提出一種模型:由鈣觸發(fā)，CyP-D輔助導(dǎo)致PiC構(gòu)象變化，從而開放mPTP[6]。

正常生理情況下，mPTP處于關(guān)閉狀態(tài)，鈣離子決定它的開放頻率。生理性的mPTP短暫開放能防止線粒體鈣超載，從而保護(hù)線粒體乃至整個(gè)細(xì)胞[7]。而在應(yīng)激條件下，mPTP的持續(xù)開放，導(dǎo)致線粒體膜電位破壞，氧化磷酸化失調(diào)、ATP耗竭，進(jìn)而影響到泵功能，加重鈣超載等離子紊亂，還可引起線粒體基質(zhì)滲透性水腫，外膜破裂，引發(fā)細(xì)胞色素 C等促凋亡因子釋放，引起細(xì)胞凋亡及壞死等不可逆損傷，出現(xiàn)缺血再灌注損傷的臨床表現(xiàn)。

2 mPTP開放誘因

已知的引起mPTP開放因素，包括鈣超載、活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、能量耗竭、線粒體跨膜電位下降、無機(jī)磷酸鹽增加、游離脂肪酸增加等細(xì)胞內(nèi)不穩(wěn)定因素[8]，其中鈣超載和氧化應(yīng)激最為重要。

2.1 鈣與mPTP

鈣超載可以誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜ANT變成“C”構(gòu)象，即細(xì)胞基質(zhì)開放構(gòu)象[9]。同時(shí)，鈣超載還觸發(fā)線粒體基質(zhì)的CyP-D與ANT結(jié)合使mPTP開放，并擴(kuò)大其開放程度、增加mPTP對鈣的敏感性?，F(xiàn)有的鈣離子引發(fā)mPTP開放的結(jié)論，多由分離出的線粒體水平實(shí)驗(yàn)得到，而在細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)中鈣引發(fā)mPTP開放的作用機(jī)制仍存在爭議，Kim等[10]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞鈣超載出現(xiàn)在mPTP開放以后，得出引發(fā)mPTP開放的物質(zhì)是ROS的結(jié)論。而在一項(xiàng)研究完整心臟mPTP開放的實(shí)驗(yàn)中，在 mPTP開放之前，就測得了緩慢移動(dòng)、高度局域化的鈣波。這種鈣波與組織氧化一起引發(fā)mPTP開放。氧化應(yīng)激常引起鈣超載，而在這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：ROS并不使整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度發(fā)生顯著變化，而只是引起緩慢移動(dòng)、高度局域化的鈣波。此外，該胞漿鈣波還可以傳遞到鄰近的細(xì)胞并促進(jìn)其mPTP開放[11]。

有研究表明，老年大鼠mPTP開放對鈣的誘發(fā)作用敏感性增加，這可能歸因于氧化心磷脂的水平隨衰老的進(jìn)展而增高。心磷脂遍布線粒體內(nèi)膜，六個(gè)心磷脂分子結(jié)合于一個(gè)ANT分子上，它們對保持ANT的正常轉(zhuǎn)運(yùn)活性有重要作用。衰老心肌氧化的心磷脂比例升高，增加了mPTP對鈣離子的敏感性。而長期的褪黑素治療[10 mg/（kg?d）持續(xù)約2個(gè)月]可抑制老年大鼠心肌對鈣離子的敏感度升高，這對減輕老年心肌缺血再灌注損傷有提示作用[12]。

2.2 ROS與mPTP

造成氧化應(yīng)激的ROS，包括自由基，如過氧化物、羥基自由基、單線態(tài)氧以及非基團(tuán)類如過氧化氫。ROS具有高反應(yīng)性并能損傷細(xì)胞組分如蛋白、脂質(zhì)和核酸。ROS的增加通過耗竭還原狀態(tài)的谷胱甘肽或還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（還原型輔酶Ⅱ）可使mPTP開放。一氧化氮（nitric oxide，NO）與超氧陰離子作用時(shí)產(chǎn)生過氧硝酸，NO和過氧硝酸鹽通過使ANT中的巰基氧化，使之載體功能喪失，開放mPTP[13,14]。

老年心肌線粒體功能減弱，導(dǎo)致 ROS積累增多，反過來加劇線粒體功能的損害[15]。超氧化物歧化酶可清除自由基，保護(hù)細(xì)胞。在細(xì)胞衰老過程中，超氧化物歧化酶活性降低，這可能會(huì)增加mPTP的開放率和時(shí)間[16]。老年心肌電子傳遞鏈復(fù)合體功能的下降與氧化應(yīng)激相關(guān)[17]，并且這導(dǎo)致的能量代謝不足促使mPTP開放。很多鈣離子通道由氧化還原反應(yīng)調(diào)控，因此，氧化應(yīng)激還可進(jìn)一步擾亂鈣離子的內(nèi)平衡[18]。

3 衰老心肌mPTP的保護(hù)

目前發(fā)現(xiàn)的一些藥物可以抑制mPTP開放，用以保護(hù)心肌細(xì)胞，然而其中一部分對老年心肌并不起保護(hù)作用，明確其相應(yīng)的機(jī)制才能推動(dòng)更有利于老年心肌保護(hù)藥物的研制和開發(fā)。

3.1 失效的保護(hù)作用

環(huán)孢素A（cyclosporine A，CsA）可與線粒體基質(zhì)的CyP-D結(jié)合，使CyP-D不能結(jié)合線粒體內(nèi)膜的ANT，抑制mPTP開放，進(jìn)而保護(hù)心肌，減小梗死面積。在Liu等[19]的一項(xiàng)研究中，CsA可以顯著降低年輕大鼠（3～5個(gè)月）心肌缺血再灌注后梗死面積，減少 NAD+從 mPTP的漏出量，延長缺血再灌注引起的mPTP開放所需的時(shí)間。而對老年大鼠（20～24個(gè)月）的心肌，則不能發(fā)揮上述心肌保護(hù)作用。

既往研究發(fā)現(xiàn)，在年輕心肌可以通過阻斷糖原合成激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3 β）抑制mPTP開放，保護(hù)心肌對抗缺血再灌注損傷。然而，Zhu等[20]在研究中發(fā)現(xiàn)：老年心肌的蛋白激酶B/GSK-3β通路對mPTP開放的抑制作用已經(jīng)在衰老過程中激活，再用異氟烷激活這一保護(hù)途徑觀察不到更為明顯的保護(hù)效果。另一研究揭示，在缺血再灌注損傷中，GSK-3β抑制劑 SB-216763（SB）的心肌保護(hù)作用存在年齡差異。SB可以磷酸化GSK-3β第九位絲氨酸，從而使其失活達(dá)到阻斷效果；缺血再灌注后，SB提高了年輕心肌中磷酸化 GSK-3β與非磷酸化GSK-3β的比值，顯著抑制了mPTP的開放；而在老年心肌中，磷酸化GSK-3β與非磷酸化GSK-3β的比值并沒有顯著上升，且發(fā)現(xiàn)老年組中未用 SB的對照組本身磷酸化 GSK-3β含量就很高。據(jù)以往研究結(jié)果推斷：在心肌衰老進(jìn)程中，氧化應(yīng)激的累積效應(yīng)使 GSK-3β磷酸化對mPTP開放的抑制作用達(dá)到極限，因此，老年心肌對GSK-3β阻滯劑已經(jīng)不再敏感[21]。

隨著衰老的進(jìn)展以及氧化應(yīng)激等各種損傷性因素長期作用的累積，老年心肌在對抗短期缺血缺氧等應(yīng)激事件時(shí)與年輕心肌不同，可能對年輕心肌具有保護(hù)效力的方式并不適用于老年心肌，而保護(hù)作用的缺失與應(yīng)用心肌保護(hù)藥物的劑量是否相關(guān)，以及導(dǎo)致老年心肌保護(hù)效應(yīng)缺失的不同方式是否存在共同通路還需要進(jìn)一步的探究。

3.2 探尋有效靶點(diǎn)

在 Bopassa等[22]的一項(xiàng)關(guān)于心肌保護(hù)的研究中，作者發(fā)現(xiàn)雌激素受體通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，Erk）通路抑制mPTP開放，起到心肌保護(hù)作用。然而，另一項(xiàng)來自于Lancaster等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，對于老年女性心肌，雌激素的保護(hù)作用降低，這一結(jié)果提示：在減輕老年女性心肌對缺血再灌注損傷方面，還需要一種更為有效的療法。研究人員深入研究了PKCε在老年、缺乏雌二醇的大鼠心臟中介導(dǎo)的心肌保護(hù)作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)PKCε可與線粒體膜上的VDAC、ANT和 HKⅡ形成復(fù)合物，進(jìn)而磷酸化細(xì)胞色素C氧化酶的Ⅳ亞基，激活線粒體的 ATP敏感鉀離子通道（mKATP通道）致mPTP關(guān)閉，起到心肌保護(hù)作用[24]。研究揭示了激活的PKCε可以在老年心肌保護(hù)中發(fā)揮作用，并發(fā)現(xiàn)了三種新的在老年心肌中發(fā)揮保護(hù)作用的線粒體靶點(diǎn)：抗氧化酶谷胱甘肽過氧化酶、錳超氧化物歧化酶（manganese super oxygen dehydrogenises，MnSOD）和熱休克蛋白 10，這為治療絕經(jīng)期后老年婦女以及年齡相關(guān)的雌二醇減少者的急性心肌缺血提供了新思路[23]。

線粒體乙酰化酶3（又名長壽蛋白3，Sirtuins3，SIRT3）是一種 NAD+依賴性去乙?；?，可脫去CyP-D第166位賴氨酸的乙?；?，阻斷CyP-D異構(gòu)酶的活性。當(dāng)CyP-D的活性高時(shí)，mPTP易于開放，通過上述途徑，SIRT3抑制mPTP的開放。其機(jī)制可能是該乙?；稽c(diǎn)與CyP-D阻滯劑CsA的結(jié)合位點(diǎn)相毗鄰，可以使CyP-D與ANT1的相互作用得到解除[25]。SIRT3敲除的小鼠心肌細(xì)胞線粒體隨著年齡的增加表現(xiàn)出對鈣離子敏感性的升高，同時(shí)還出現(xiàn)心肌衰老加速的跡象，例如13月齡的SIRT3敲除小鼠的心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大和纖維化，并對腹主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致的心臟應(yīng)激高度敏感[26]。乙醇可抑制SIRT3的活性，從而提高CyP-D的活性，進(jìn)而促進(jìn)CyP-D與ANT1（心肌中存在的一種ANT異構(gòu)體的主要形式[27]）的相互作用，加強(qiáng)mPTP的開放。另有研究表明，乙醇對 SIRT3的這種抑制作用可被AMP 激活的蛋白激酶逆轉(zhuǎn)[28]。

4 總結(jié)與展望

目前，關(guān)于心肌細(xì)胞mPTP的研究仍有很多問題尚待解決，例如 mPTP的分子構(gòu)成、鈣離子對mPTP開放的觸發(fā)作用的分子機(jī)制尚不明確。此外，目前很多文獻(xiàn)的結(jié)論是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上得出的，然而衰老過程在不同種屬之間有著較強(qiáng)差異性[29,30]，這些結(jié)論是否也適用于人類的心肌細(xì)胞并沒有定論。因此，闡明mPTP在衰老心肌細(xì)胞中的開放調(diào)節(jié)機(jī)制將為開發(fā)更好的、更有效的心肌保護(hù)藥物、優(yōu)化心肌保護(hù)策略、提升老年人心血管疾病診療水平提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

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