D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)

吳克芬, 胡 予

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D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型的建立及評(píng)價(jià)

吳克芬, 胡 予

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院老年病科, 上海 200032)

建立衰老動(dòng)物模型是研究人類衰老過程的有效方法。結(jié)合動(dòng)物的生理特性及自然屬性, 建立不同的動(dòng)物模型, 已成為衰老及抗衰老研究的焦點(diǎn)。D-半乳糖衰老動(dòng)物模型與其他幾種衰老動(dòng)物模型（如自然衰老模型、臭氧損傷衰老模型、去胸腺衰老模型、SAMP系小鼠衰老模型等）相比, 簡(jiǎn)便易行, 價(jià)格低廉, 結(jié)果穩(wěn)定, 因而得到廣泛應(yīng)用。結(jié)合該模型近年來的運(yùn)用和發(fā)展, 本文對(duì)該模型構(gòu)建原理、劑量、具體方法和評(píng)估手段作一綜述, 并對(duì)行為學(xué)水平、生化水平、形態(tài)學(xué)水平、分子生物水平檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行總結(jié)。總之, 采用D-半乳糖 120～125mg/（kg·d）連續(xù)皮下注射6～8周是較為可靠、穩(wěn)定的建立衰老動(dòng)物模型的方法。

D-半乳糖; 衰老; 模型, 動(dòng)物

衰老又稱老化, 是生物體在生命后期階段所出現(xiàn)的進(jìn)行性、全身性、十分復(fù)雜的退化過程, 它是指隨著年齡增大, 自身機(jī)能減退, 結(jié)構(gòu)功能逐步退行性變, 趨向死亡且不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。2007年聯(lián)合國(guó)經(jīng)濟(jì)和社會(huì)事務(wù)部發(fā)表的《2007年世界經(jīng)濟(jì)和社會(huì)調(diào)查報(bào)告》顯示, 全球大多數(shù)國(guó)家正迅速進(jìn)入老齡化社會(huì), 2005～2050年, 世界人口增加的一半是＞60歲的老年人, ＞80歲的人口將從9000萬增加到4億[1]。因此, 與衰老相關(guān)的各種老年疾病及如何延緩衰老成為老齡化社會(huì)關(guān)注的熱點(diǎn)。在科學(xué)研究中, 理論上以自然衰老動(dòng)物為模型進(jìn)行研究最理想, 但存在飼養(yǎng)周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴, 并且動(dòng)物來源有可能非同一批動(dòng)物, 進(jìn)而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不可靠的缺點(diǎn)。因此建立衰老動(dòng)物模型將越來越普及、越來越重要。

1 常見的衰老動(dòng)物模型

1.1 自然衰老模型

趙彩紅等[2]對(duì)自然衰老小鼠進(jìn)行評(píng)價(jià), 結(jié)果顯示自然衰老小鼠的抗疲勞能力、常壓耐缺氧能力、T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和溶血素的水平顯著降低, Y迷宮智力測(cè)驗(yàn)及跳臺(tái)智力測(cè)驗(yàn)的錯(cuò)誤反應(yīng)率均顯著升高, 表明小鼠自然衰老后, 抗應(yīng)激能力低下, 免疫功能降低, 學(xué)習(xí)記憶功能減退。理論上采用自然衰老動(dòng)物進(jìn)行衰老研究是最為科學(xué)和理想的。但這一模型存在一些不足: （1）老年動(dòng)物難以得到, 其來源不統(tǒng)一、飼養(yǎng)周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴等因素導(dǎo)致其在實(shí)驗(yàn)中難以發(fā)揮作用; （2）老年動(dòng)物的健康狀況差, 死亡率高, 在藥物吸收、代謝、分布上的變異性大, 有時(shí)會(huì)產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)意義不確定的結(jié)果, 故多采用人工衰老動(dòng)物模型進(jìn)行研究。

1.2 人工衰老動(dòng)物模型

根據(jù)研究目的不同, 可選用不同的動(dòng)物采取D-半乳糖（D-galacose, D-gal）注射、β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein, β-AP）注射、快速老化小鼠（senescence accelerated mouse, SAMP）、輻照γ射線、臭氧（O3）損傷、AlCl3致急性衰老模型、去除胸腺等方法建立衰老模型。

1.2.1 D-gal注射法 機(jī)制及方法詳見后述。

1.2.2 SAMP系小鼠快速衰老模型 SAM小鼠在日本東京大學(xué)首次培育成功, 目前共有12個(gè)亞系[3], 不同亞系小鼠具有不同的病理表現(xiàn)型。如在增齡過程中, 快速衰老小鼠P系1代（SAMP1）主要特征為免疫功能低下, SAMP2以肺部病變?yōu)橹? SAMP3為變形骨關(guān)節(jié)病, SAMP6為伴有主動(dòng)脈形態(tài)結(jié)構(gòu)異常及中膜輕度鈣化, SAMP8為衰老及學(xué)習(xí)記憶能力減退, SAMP9為白內(nèi)障, SAMP10為伴有腦萎縮的學(xué)習(xí)記憶及情感障礙。這些與衰老相關(guān)的病理改變與許多人類老年性疾病的病理改變相似。并且小鼠遺傳信息極為豐富, 與人類遺傳學(xué)特征亦有相似性。因此, 研究者可根據(jù)研究目的的不同選擇相應(yīng)的SAM小鼠作為衰老動(dòng)物模型。但SAM模型也存在缺點(diǎn), 如價(jià)格昂貴、存在基因缺陷、來源不足等。

1.2.3 輻照γ射線 γ射線能使大鼠機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生多種自由基, 啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)鏈, 增加細(xì)胞的通透性, 攻擊生物膜。同時(shí)輻射也能使氧化酶和非氧化酶活性系統(tǒng)的防御機(jī)制減弱, 白細(xì)胞總數(shù)和血紅蛋白明顯降低。大鼠的輻照吸收劑量為3 Gy較為理想, 輻照面積為25 cm×25 cm, 輻照源距動(dòng)物高度為80 cm, 每次輻照為4 min 53 s, 連續(xù)輻照5 d能快速、有效地建立衰老動(dòng)物模型。

1.2.4 β-AP β-AP是與老年癡呆密切相關(guān)且存在于老年癡呆患者大腦內(nèi)的一種特有蛋白, 雙側(cè)海馬內(nèi)單次注射β-AP引起大鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降。β-AP具有沉積作用和神經(jīng)毒性, 較高濃度的β-AP能引起神經(jīng)退化和死亡; β-AP的神經(jīng)毒性作用還可增強(qiáng)或加大各種損害性刺激的細(xì)胞損傷效應(yīng)。在D-半乳糖致衰老的基礎(chǔ)上, 海馬內(nèi)注射β-AP有望成為建立衰老動(dòng)物模型的有效方法[4]。

1.2.5 AlCl3致急性衰老模型 鋁是大腦細(xì)胞的傷害因子, 是阿爾茨海默病的危險(xiǎn)因素之一。鋁進(jìn)入大腦及大腦細(xì)胞產(chǎn)生至少以下3種病理作用:（1）神經(jīng)原纖維形成異常的T型結(jié)構(gòu), 使其相互纏結(jié); （2）大腦細(xì)胞產(chǎn)生淀粉樣前體蛋白而形成老年斑;（3）通過組織相容性系統(tǒng), 產(chǎn)生過量的氧自由基造成對(duì)腦神經(jīng)系統(tǒng)的損害。目前采用AlCl3的大白鼠急性衰老模型是公認(rèn)的阿爾茨海默病病理模型。

1.2.6 去胸腺致衰老 去除胸腺的動(dòng)物模型類似于人衰老后各器官的退化狀態(tài), 因此可作為一種衰老模型。

1.2.7 臭氧損傷法 臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑, 能與有機(jī)分子作用產(chǎn)生自由基, 使細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化物鏈反應(yīng), 其產(chǎn)物作用于蛋白質(zhì)分子和某些酶, 使其生物活性受到影響。臭氧致衰老的動(dòng)物模型在形態(tài)學(xué)、行為學(xué)以及單胺氧化酶活性、脂質(zhì)過氧化物、超微結(jié)構(gòu)等方面的指標(biāo)已被證實(shí)與自然衰老動(dòng)物相似。

我國(guó)幅員遼闊,場(chǎng)地類型較多,很多地區(qū)都處于火山地震帶,地震較為頻繁.尤其是特高壓輸電,隨著輸電電壓等級(jí)的提高,輸電塔的高度和重量也隨之增加,地震載荷對(duì)結(jié)構(gòu)的影響必然增大.現(xiàn)階段我國(guó)對(duì)特高壓輸電桿塔的抗震設(shè)計(jì)并不明確,在《電力設(shè)施抗震設(shè)計(jì)規(guī)范》(GB 50260—2013)和《架空送電線路桿塔結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)技術(shù)規(guī)定》(DL/T 5154—2002)僅對(duì)500 kV 以下桿塔結(jié)構(gòu)做出規(guī)定:8度及8度以下時(shí),自立式鐵塔可不進(jìn)行抗震驗(yàn)算.為此,對(duì)特高壓輸電線路進(jìn)行地震響應(yīng)分析,在特高壓輸電線路設(shè)計(jì)時(shí)進(jìn)行抗震設(shè)計(jì)是十分必要的.

2 D-gal衰老動(dòng)物模型的機(jī)制

2.1 D-gal的來源和體內(nèi)分布

D-gal是一種小分子單糖, 分子中含有6個(gè)碳原子, 和D-葡萄糖互為同分異構(gòu)體。食物中D-gal主要來源于哺乳動(dòng)物的乳汁, 一分子乳糖水解生成一分子葡萄糖和一分子D-gal。D-gal是一種生理營(yíng)養(yǎng)成分, 在正常機(jī)體代謝中可轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟? 參與葡萄糖代謝, 但過量供給會(huì)導(dǎo)致代謝紊亂。D-gal在體內(nèi)主要的代謝途徑為:（1）在正常情況下, 半乳糖通過半乳糖激酶和1-磷酸半乳糖尿苷轉(zhuǎn)移酶的作用, 生成1-磷酸葡萄糖, 進(jìn)入三羧酸循環(huán);（2）當(dāng)體內(nèi)積聚了過量的D-gal時(shí), 半乳糖會(huì)在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇。有研究表明, 半乳糖醇大量堆積會(huì)導(dǎo)致毒性反應(yīng), 如體內(nèi)NADPH耗竭, 影響巰基鏈功能, 導(dǎo)致晶體蛋白交聯(lián)失去透明性等;（3）半乳糖脫氫酶在激活后, 可轉(zhuǎn)化成半乳糖氧化酶（galactose, GOA）, GOA可使半乳糖醇氧化, 生成醛和H2O--2。這一途徑總共可以產(chǎn)生三種活性氧自由基（reactive oxygen species, ROS）。

2.2 D-gal的主要代謝途徑

半乳糖是動(dòng)物體內(nèi)的正常代謝產(chǎn)物。哺乳動(dòng)物從乳糖中獲得半乳糖, 乳糖在體內(nèi)水解生成葡萄糖和半乳糖, 而半乳糖在肝臟中迅速被酶解成葡萄糖。半乳糖代謝異常會(huì)引起動(dòng)物生理功能顯著變化。半乳糖血癥是一種染色體隱形遺傳的糖類代謝遺傳疾病。體內(nèi)半乳糖及其代謝物濃度異常升高所致代謝障礙使患者的肝臟、腎臟、腦組織和晶狀體成為主要受累器官, 可引發(fā)白內(nèi)障、肝腫大、肝硬化等并發(fā)癥。鑒于半乳糖代謝的特點(diǎn), 研究者通過大劑量D-gal的給予而造成動(dòng)物糖代謝紊亂, 可成功建立具有特殊研究目的的動(dòng)物模型。

2.3 D-gal致動(dòng)物衰老模型機(jī)制

D-gal模型最早在國(guó)外應(yīng)用于白內(nèi)障研究, 1985年我國(guó)學(xué)者徐黻本等首次在延緩衰老藥物療效實(shí)驗(yàn)中使用D-gal模型作為衰老模型文獻(xiàn)。D-gal在各種衰老動(dòng)物模型中應(yīng)用廣泛, 能夠誘導(dǎo)各組織器官的疾病衰老, 并且與臨床一些疾病也密切相關(guān), 但是具體機(jī)制還不明了。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量的研究, 先后提出了糖代謝紊亂學(xué)說、自由基氧化損傷學(xué)說、半乳糖醇中毒學(xué)說、羰基毒化衰老學(xué)說等觀點(diǎn)。

2.3.1 糖代謝學(xué)說 早期的研究認(rèn)為, 在一定時(shí)間內(nèi), 連續(xù)給動(dòng)物注射大劑量的D-gal, 使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高, D-gal代謝主要在肝組織, 在醛糖還原酶的催化下, 還原成半乳糖醇, 不能被細(xì)胞進(jìn)一步代謝而堆積在細(xì)胞內(nèi), 影響正常滲透壓, 導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、功能障礙、代謝紊亂, 破壞并消耗機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng), 最終致使衰老的發(fā)生, 即衰老的代謝學(xué)說。但這種途徑多伴有白內(nèi)障、髓鞘變性、神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢等糖尿病并發(fā)癥、神經(jīng)炎性病變等, 而多數(shù)D-gal衰老模型的研究并未報(bào)道這些改變。因此, 該機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.3.2 自由基學(xué)說 D-gal衰老模型的氧化損傷機(jī)理最早由李文彬等提出[5], 他們利用D-gal皮下注射制成大鼠衰老模型, 發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦、心、肝中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性下降, 脂褐素、MDA含量和單胺氧化酶-B（MAO-B）活性升高, 應(yīng)用電子自旋共振檢測(cè)出海馬中O2-水平明顯增高, 因而首次提出了自由基致衰老學(xué)說。

自由基的氧化積累會(huì)損傷細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜脂質(zhì)等大分子, 致使機(jī)體逐漸衰老。個(gè)體的代謝率越高, 自由基的氧化積累越快, 由此造成的細(xì)胞損傷也越大, 其壽命也就越短。在D-半乳糖誘導(dǎo)衰老模型中, 過量的D-半乳糖的給予導(dǎo)致了機(jī)體代謝率的提高, 由此產(chǎn)生了由于自由基的增加而引起的一系列與氧化應(yīng)激相關(guān)的病理生理變化[6]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn): D-半乳糖模型大鼠腦、胃、肝、大腸、小腸的線粒體和細(xì)胞漿中SOD、脂質(zhì)過氧化物、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（catalase, CAT）、黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase, XOD）、過氧化硝基（ONOO-）有顯著變化。同時(shí), D-半乳糖處理組大鼠體內(nèi)多種抗氧化酶活性下降, Na＋/K＋-ATP酶（鈉泵）、Ca2＋含量、一氧化氮（NO）、血管緊張素II和胰島素活性與正常小鼠直接存在顯著性差異, Zn2＋/Cu2＋比值也下降, 主要臟器的脂褐素、脂質(zhì)過氧化物增多, 皮膚羥脯氨酸含量降低。

另外, 李文彬等[5]在系統(tǒng)研究后提出了D-gal活性氧應(yīng)激效應(yīng)態(tài)是擬衰老和腦老化的啟動(dòng)因子學(xué)說。他認(rèn)為, D-gal合成酶的作用, 產(chǎn)生了O2－和H2O2等活性氧, 導(dǎo)致SOD活性下降, MDA和脂褐質(zhì)（LIP）水平升高, 其中活性氧是D-gal擬老化作用的啟動(dòng)因子, 而基因表達(dá)和調(diào)控過程受累是重要環(huán)節(jié)。D-gal進(jìn)入體內(nèi)引起的氧自由基代謝失衡是誘發(fā)衰老的主要原因這一機(jī)制現(xiàn)得到普遍公認(rèn)。

2.3.4 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中, 神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor, NGF）通過與轉(zhuǎn)羥乙醛酶（Trk）受體結(jié)合, 激活神經(jīng)元存活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 啟動(dòng)磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑, 通過PI3K-Akt-CREB-pCREB通路, 使神經(jīng)元存活并維持正常功能。當(dāng)各種原因引起神經(jīng)存活因子減少或損傷性因素對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路的刺激減弱, 使多種維持神經(jīng)元存活的重要蛋白不能隨之激活時(shí), 則引起神經(jīng)元功能減退和神經(jīng)元退行性變。研究發(fā)現(xiàn), D-gal模型小鼠海馬神經(jīng)元PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的多種重要蛋白質(zhì)均處于低水平表達(dá)[8]。D-gal還可通過半胱天冬酶的介導(dǎo)促進(jìn)神經(jīng)元程序性壞死及抑制神經(jīng)干細(xì)胞遷移核心的神經(jīng)細(xì)胞生成, 增加神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷。

2.3.5 相關(guān)基因表達(dá) 研究證明, D-gal使原癌基因和表達(dá)下降, RNA含量減少。此外, 在研究D-gal誘導(dǎo)大鼠白內(nèi)障形成過程中發(fā)現(xiàn)晶狀體上皮細(xì)胞的原癌基因高表達(dá)增加。

3 D-gal致衰老動(dòng)物模型的建立

3.1 D-gal衰老模型動(dòng)物來源

選用D-gal來建立衰老動(dòng)物模型時(shí)發(fā)現(xiàn), 雄性大鼠相對(duì)于雌性大鼠更為敏感, 可以首選雄性SD大鼠作為動(dòng)物來源。但亦可選用Wistar大鼠、昆明小鼠、ICR小鼠等。

3.2 D-gal注射方法

D-gal誘導(dǎo)衰老動(dòng)物模型可采用腹腔注射、皮下注射的方式。但考慮D-gal對(duì)肝臟存在一定的毒副作用, 較少采用腹腔注射。同時(shí)需要D-gal緩慢吸收, 故多采用皮下注射方式。皮下注射部位在文獻(xiàn)中沒有具體規(guī)定, 一般為安全及注射方便起見, 可選取頸背部皮下、側(cè)腹壁或后肢外側(cè)皮下。李春海等[9]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn), 大小鼠口服D-gal 700 mg/kg連續(xù)6周, 可獲得較好的擬衰老效應(yīng), 與皮下注射70 mg/（kg·d）連續(xù)6周所產(chǎn)生的衰老效應(yīng)基本相似。但口服D-gal致動(dòng)物衰老效果缺乏進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究的支持。

3.3 D-gal注射劑量

D-gal致衰老動(dòng)物模型所需劑量及時(shí)間尚無統(tǒng)一規(guī)定, 劑量范圍從50～1250 mg/（kg·d）不等。但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 在制備D-gal衰老大鼠或小鼠模型時(shí), 給D-gal 50～500 mg/（kg·d）, 連續(xù)6～8周比較合適[10]。徐智等[11]通過不同劑量D-gal造模結(jié)果與正常衰老大鼠比較, 發(fā)現(xiàn)D-gal 125 mg/（kg·d）皮下注射40 d, 可得到相當(dāng)于24個(gè)月齡大鼠的模型。崔美芝等[12]采用D-gal 500 mg/（kg·d）腹腔注射56 d與20月齡自然大鼠比較其血清血糖、膽固醇等生化指標(biāo)及血清SOD值、MDA值等無顯著差異。

3.4 D-gal造模注意事項(xiàng)

制作D-gal致衰老動(dòng)物模型時(shí), 給藥時(shí)間應(yīng)準(zhǔn)時(shí), 注射時(shí)注意無菌操作, 避免模型制作后期大鼠因感染而死亡或致造模失敗。另外D-gal溶液需妥善密封保存, 避免變質(zhì)。

3.5 D-gal造模的優(yōu)缺點(diǎn)

簡(jiǎn)便易行（成模時(shí)間短）、價(jià)格低廉、結(jié)果穩(wěn)定（重復(fù)性好）是D-gal致衰老動(dòng)物模型的優(yōu)點(diǎn)。這種方法不僅可用于建立衰老大鼠動(dòng)物模型, 還可用于建立衰老小鼠動(dòng)物模型, 但D-gal皮下注射所需時(shí)間較之臭氧等方法造模的時(shí)間長(zhǎng)。

D-gal模型鼠是由化學(xué)損傷造成的, 難以真實(shí)反應(yīng)衰老的生理生化改變, 因此, D-gal模型鼠不宜應(yīng)用于免疫、行為等方面的衰老研究。相對(duì)而言更適合于氧化損傷方面的研究[13]。

4 D-gal致衰老動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)

4.1 外觀特征

觀察指標(biāo)包括實(shí)驗(yàn)鼠體重下降, 毛色枯黃, 行動(dòng)遲緩, 精神萎靡等。

4.2 血液、組織生化指標(biāo)檢測(cè)

常用的有（1）血清、紅細(xì)胞、腦、肝組織MDA或MAO-B、含量血清脂質(zhì)過氧化物（Lipid oxygen, LPO）及SOD活力;（2）血清溶血素檢測(cè);（3）腦、心、肝中脂褐素含量;（4）血糖、血清膽固醇含量;（5）胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、體重增長(zhǎng)率。徐智等[11]將D-gal衰老大鼠的酶學(xué)指標(biāo)、生理生化指標(biāo)和免疫指標(biāo)分別與3月齡鼠和24月齡鼠比較, 化學(xué)比色法測(cè)定血清SOD活性, 熒光分光光度法測(cè)定腦、心、肝中脂褐素含量, 結(jié)果顯示D-gal衰老大鼠腦中MAO-B活性、血清LPO含量較3月齡大鼠明顯增高, 而SOD活力較3月齡大鼠明顯降低。上述指標(biāo)與24月齡大鼠無顯著差異。證明了D-gal衰老動(dòng)物明顯的可靠性。

較少使用的還有內(nèi)耳組織谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、Na＋-K＋-ATP酶檢測(cè), 血清白介素2（interleukin-2, IL-2）含量測(cè)定。研究表明內(nèi)耳組織GSH-Px、Na＋-K＋-ATP酶在D-gal衰老模型鼠中活性顯著下降[14]; IL-2含量亦較正常動(dòng)物明顯降低[15]。

4.3 行為學(xué)檢測(cè)

常用的有迷宮試驗(yàn)、游泳水迷宮試驗(yàn)、興奮性試驗(yàn)、跳臺(tái)被動(dòng)回避試驗(yàn)等。這種行為學(xué)檢測(cè)多用于研究衰老大鼠或小鼠學(xué)習(xí)、記憶、辨別能力的改變方面。如迷宮試驗(yàn)即在一個(gè)Y型迷宮內(nèi)（分安全區(qū)和電擊區(qū)）, 給小鼠電擊刺激, 迫使它逃避并獲得迅速找到安全區(qū)的記憶力, 觀察小鼠空間分辨的學(xué)習(xí)和記憶能力。凡小鼠受電擊后能直接逃至安全區(qū)為正確反應(yīng), 否則為錯(cuò)誤反應(yīng)。每只小鼠訓(xùn)練10次, 分別在24 h后、48 h后測(cè)其記憶力情況。D-gal小鼠較正常小鼠在第1, 2, 3 d訓(xùn)練時(shí)正確反應(yīng)明顯減少, 學(xué)習(xí)記憶辨別能力明顯下降。對(duì)D-gal大鼠的研究常應(yīng)用上述研究方法檢測(cè)衰老大鼠探究行為及空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降情況。

4.4 形態(tài)學(xué)研究

研究較多的是神經(jīng)病理學(xué)變化, 如大腦皮層的形態(tài)學(xué)變化等。采用TUNEL法檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)D-gal大鼠齒狀腦回、海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)TUNEL陽性細(xì)胞顯著增加, 觀察到細(xì)胞萎縮和大量核固縮, 即大量神經(jīng)元變性[16]。原淑娟等[17]應(yīng)用透射電鏡結(jié)合圖像分析對(duì)大鼠海馬CA3區(qū)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察, 發(fā)現(xiàn)D-gal模型大鼠海馬CA3區(qū)突觸后致密物厚度變薄, 突觸間寬度增大, 突觸活性區(qū)長(zhǎng)度縮短。這些改變是導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶行為障礙的基礎(chǔ)。

另外, D-gal模型小鼠的晶狀體、視網(wǎng)膜色素上皮、脈絡(luò)膜的高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物特殊熒光減弱, 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增大, 基底側(cè)面連接減少, Bruch膜增厚, 外膠質(zhì)層突出, 絨毛毛細(xì)血管基底膜裂開、增厚, 絨毛毛細(xì)血管內(nèi)皮穿孔出現(xiàn)損傷。

4.5 分子生物學(xué)檢測(cè)

將從內(nèi)耳組織中提取的線粒體DNA采用巢式PCR進(jìn)行DNA檢測(cè)從而了解衰老情況, 結(jié)果顯示D-gal衰老模型組小鼠內(nèi)耳線粒體DNA缺失明顯[14]。徐智等[11]取大鼠的腦、心肌、肝組織用熒光分光光度法進(jìn)行脂褐素測(cè)定, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型鼠該指標(biāo)含量增加。用PCR-ELISA法進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)模型小鼠該指標(biāo)活性顯著下降[18]。

綜上所述, 采用D-gal 120～125 mg/（kg·d）連續(xù)皮下注射6～8周建立衰老動(dòng)物模型是較為可靠、穩(wěn)定的。但畢竟衰老模型動(dòng)物與自然衰老動(dòng)物的各種指標(biāo)間有一定的差異, 且該模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)較多, 沒有一項(xiàng)單一指標(biāo)可全面、正確反映衰老的形態(tài)、生理或免疫等方面的變化, 因此應(yīng)根據(jù)所研究的具體內(nèi)容有針對(duì)性地選用其中某些指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè), 從而更科學(xué)地進(jìn)行與衰老有關(guān)的疾病、機(jī)制、藥物方面等的研究。

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（編輯: 任開環(huán)）

Establishment and evaluation of D-galactose induced aging animal model

WU Kefen, HU Yu

(Department of Geriatrics, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Establishment of aging animal model is an effective way to study the aging process of human being. It has been a focus to establish different aging models for research of aging and anti-aging agents according to the physiological characteristics and natural attributes of various animals. Compared with other aging models, including naturally aging model, ozone induced aging model, thymus removed aging model, and aging SAMP model, D-galactosis induced aging model has been widely used because of its easy feasibility, low lost, and stable performance. In this paper, regarding its application and development, we reviewed the D-galactosis induced aging models from the following aspects: the mechanism and the dosage of the D-galactose to induce aging, the specific protocols, and the evaluation for successful establishment. In addition, we summarized some indexes to assess aging, such as behavioral, biochemical, morphological and molecular biological indices. In summary, subcutaneous injection of 120～125mg/(kg·d) of D-galactose once per day for 6 to 8 weeks is a reliable and stable way to establish the aging model.

D-galactose; aging; models, animal

R332

A

10.3724/SP.J.1264.2012.00018

2011-02-16;

2011-03-1

胡 予, Tel: 021-64041990, E-mail: hu.yu@zs-hospital.sh.cn