定量檢測(cè)毒品的蛋白芯片的研發(fā)

曾立波，陳連康，胡小龍，陳復(fù)華，丁國(guó)榮，張玉榮，張潤(rùn)生，梁晨，曹芳琦

（上海市公安局物證鑒定中心，上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200083）

隨著非法制毒、販毒、吸毒的案件日趨增加，送檢的毒品檢材在數(shù)量和種類上都比以前明顯增多。目前在檢驗(yàn)鑒定工作中存在以下問(wèn)題：常規(guī)的檢驗(yàn)技術(shù)是儀器分析，存在以下不足：（1）檢測(cè)通量低，儀器每次只能對(duì)一個(gè)樣品或一種毒品和毒物成分進(jìn)行檢驗(yàn)鑒定，如果遇到嚴(yán)打?qū)ｍ?xiàng)斗爭(zhēng)和發(fā)生特發(fā)事件，成百上千份樣本的測(cè)定和幾十種毒品需要定性篩查時(shí)，此法便顯出了其通量小的缺陷；（2）檢測(cè)速度慢，分析操作周期長(zhǎng)和煩瑣，一個(gè)樣品的檢測(cè)時(shí)間約需幾小時(shí)以上，難以在廣大基層單位推廣，更不能在現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)。

生物芯片技術(shù)是九十年代中期興起的一種新型生物學(xué)技術(shù)，它的特點(diǎn)是將生命科學(xué)研究中所涉及的樣品反應(yīng)、檢測(cè)、分析等過(guò)程連續(xù)化、集成化、微型化。由于其檢測(cè)信號(hào)的高通量、良好的檢測(cè)靈敏度和數(shù)據(jù)回收率，生物芯片技術(shù)迅速成為目前生命科學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)展最快的技術(shù)之一[1]。

蛋白質(zhì)芯片，又稱蛋白質(zhì)陣列或蛋白質(zhì)微陣列，基于抗原和抗體專一性結(jié)合的原理，將多種蛋白質(zhì)有序地固定在固相載體（如：特殊處理的玻片、有機(jī)膜片、硅微球等）表面形成微陣列，檢測(cè)生物樣品中可與之專一性結(jié)合的對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)[2]。用標(biāo)記了熒光的蛋白質(zhì)，經(jīng)熒光掃描等檢測(cè)方式測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，來(lái)分析蛋白之間或蛋白與其它分子之間的相互作用關(guān)系。本項(xiàng)目利用蛋白芯片檢測(cè)毒品毒物的基礎(chǔ)是免疫反應(yīng)。預(yù)先在固相基質(zhì)上通過(guò)化學(xué)方法固定載體蛋白偶聯(lián)的毒品毒物小分子，檢測(cè)過(guò)程中將毒品毒物抗體與待測(cè)樣品同時(shí)加入，樣品種的毒品毒物與固定在基質(zhì)上的小分子完全抗原針對(duì)毒品毒物抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)，沒(méi)能結(jié)合在芯片上的抗體在洗滌步驟中被除去，然后加入熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育，最后通過(guò)芯片掃描儀獲得檢測(cè)結(jié)果[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

嗎啡和甲基苯丙胺單克隆抗體、嗎啡和甲基苯丙胺等毒品與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物（MOR-BSA，METBSA）為本實(shí)驗(yàn)室自制；硝酸纖維素膜為Whatman公司產(chǎn)品；嗎啡和甲基苯丙胺等毒品標(biāo)準(zhǔn)品為公安部第二研究所提供；高速冷凍離心機(jī)為上海飛鴿離心機(jī)廠產(chǎn)品；點(diǎn)樣系統(tǒng)AD 1500為Bio-dot公司產(chǎn)品；掃描儀InnoScan 710購(gòu)自INNOPSYS；Cy5熒光標(biāo)記 （上海開(kāi)放生物科技有限公司）；小牛血清白蛋白（Sigma公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 毒品完全抗原的制備（以嗎啡為例）

采用琥珀酸酐法：稱取硫酸嗎啡20mg，與3倍的琥珀酸酐在苯中回流反應(yīng)4h，蒸干溶劑，用乙醇洗滌，得到6-琥珀酰嗎啡（M-6-S）的固體粉末。6-琥珀酰嗎啡與蛋白質(zhì)的連接采用碳二酸酐法：稱取，10mg的BSA（牛血清白蛋白）溶于10mL PBS（磷酸鹽緩沖液）中，加入60mg EDC（碳二亞胺）室溫下攪拌下反應(yīng)2～3 h，將反應(yīng)液10 000 rpm離心除去不溶物，將1.3.1中的6-琥珀酰嗎啡（M-6-S）20mg，溶于500uL H2O中，逐滴滴入BSA（牛血清白蛋白）溶液中，室溫反應(yīng)12h。反應(yīng)產(chǎn)物在4℃，用0.01M，pH 7.4磷酸鹽緩沖液透析，期間更換緩沖液3～4次，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。最后用紫外光譜法鑒定，即得完全抗原。其它毒品均通過(guò)類似方法引入活性基團(tuán)，再與載體蛋白通過(guò)交聯(lián)劑偶聯(lián)獲得完全抗原。

5mg羊抗鼠IgG多抗溶于2.5ml 0.1M pH8.3的碳酸緩沖液，將Cy5 NHS easter（羥基琥珀酰亞胺酯）溶于DMF濃度為10 mg/ml，加入100 ul的Cy5 NHS easter到抗體溶液中，室溫下反應(yīng)2h，用G25柱除去小分子，標(biāo)記好的抗體儲(chǔ)存于4℃。

1.2.3 毒品蛋白芯片的制備

包括如下步驟：將含有活化基團(tuán)的硝酸纖維膜芯片片基；置于自動(dòng)點(diǎn)樣儀中，用緩沖液進(jìn)行梯度稀釋的毒品偶聯(lián)物抗原和質(zhì)控蛋白進(jìn)行精確點(diǎn)樣，將10nL的毒品偶聯(lián)物（濃度在300~500ug/mL）地點(diǎn)在固體芯片上進(jìn)行包被。室溫下（25℃）放置3h使之干燥；用含3%BSA 0.5%Tween-20 0.5%PVA（Polyvinyl alcohol）的0.01M pH 7.4的PBS封閉1h；用雙蒸水沖洗后在真空干燥箱內(nèi)干燥，干燥劑、密封4℃保存。形成分離測(cè)試區(qū)域，而且不會(huì)破壞抗體的組成和構(gòu)造。抗體溶液的分配量由電腦嚴(yán)格控制，保證可以精確的應(yīng)用到芯片表面。

1.2.4 毒品蛋白芯片的靈敏度及線性的檢測(cè)

將制備好的芯片用雙蒸水清洗，晾干后，將毒品抗體以1：500稀釋，加到芯片上，孵育30min，PBS-T洗滌4次，每次10 min，最后用雙蒸水沖洗，再加入1：2000 CY5的標(biāo)記羊抗鼠IgG多抗，孵育30 min，PBS-T洗滌后用ScanArray3000掃描儀掃描，用圖像分析軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析。計(jì)算各每個(gè)矩陣的平均熒光強(qiáng)度，所得數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。確定線性范圍和最低檢出濃度。

1.2.5 毒品蛋白芯片的準(zhǔn)確性研究

通過(guò)對(duì)506例樣本的檢測(cè)，同時(shí)GC-MS樣本中毒品的含量，以每種毒品的閾值為陰性、陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，將毒品芯片檢測(cè)結(jié)果與GC-MS結(jié)果比較，得到最終的總符合率，確定毒品蛋白芯片檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.2.6 毒品蛋白芯片的穩(wěn)定性研究

在無(wú)際的黑夜里，你想過(guò)曾經(jīng)最愛(ài)的文字。從前你將它們想象成可以在指尖躍動(dòng)的音符，每翻開(kāi)一本書(shū)時(shí)它們便蹦跳著，奔跑著，在透明的空氣里穿針引線，在你的耳朵里纏繞出琴弦，演奏出那一首獨(dú)屬于你的“小確幸”。你提筆創(chuàng)作的時(shí)候是你最耀眼的時(shí)候，就像陽(yáng)光在你的身上鍍了一層淺淺的金。你認(rèn)真地譜寫(xiě)曲子，一曲終了，酣暢淋漓。

評(píng)估芯片微陣列的穩(wěn)定性，將毒品檢測(cè)芯片儲(chǔ)存在37℃下28 d，并且信號(hào)強(qiáng)度在28 d研究之前和之后各確定一次。

2 結(jié)果

2.1 毒品蛋白芯片的標(biāo)準(zhǔn)曲線

競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定方法適用于毒品小分子的檢測(cè)，如果樣本中含有毒品，它會(huì)與完全抗原競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)。這將會(huì)降低標(biāo)記的抗體的結(jié)合的數(shù)量，發(fā)光信號(hào)會(huì)減弱。在競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)中，光信號(hào)的強(qiáng)弱與樣本中出現(xiàn)的毒品的濃度成相反的比例關(guān)系。用梯度稀釋的毒品標(biāo)準(zhǔn)品制備出芯片的標(biāo)準(zhǔn)曲線，為典型的免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)曲線（見(jiàn)圖1）。四參數(shù)logistic分析的回歸方程：Y=（A-D）/[1+（X/C）^B]+D，R2=0.99165其中X代表樣本濃度（ng/ml），Y代表化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，A、B、C、D為競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定參數(shù)。

圖1 用嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品制備的芯片檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1 與GC/MS結(jié)果比較結(jié)果

用芯片對(duì)多個(gè)尿樣樣本的進(jìn)行幾種常見(jiàn)毒品的定量檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與GC-MS檢測(cè)結(jié)果比較，結(jié)果顯示毒品芯片與GC-MS檢測(cè)具有較高的相關(guān)性，嗎啡、甲基苯丙胺、苯丙胺和氯胺酮的相關(guān)性分別為：88%，93.2%，94.1%和90.6%（見(jiàn)表1）。

2.2 芯片檢測(cè)的毒品種類和靈敏度

本項(xiàng)目制備的毒品檢測(cè)芯片的靈敏度如以圖表所示，和目前的膠體金快速檢測(cè)試劑盒相比較，其尿液中檢測(cè)所有毒品的靈敏度均提高了10倍以上（見(jiàn)表2）。

2.3 特異性

在芯片的特異性檢測(cè)試驗(yàn)中，我們選用苯丙胺，甲基苯丙胺。氯胺酮，去甲氯胺酮，嗎啡，美沙酮，度冷丁，海洛因，麻黃素，左旋麻黃素，右旋麻黃素，MDMA，可待因，大麻，可卡因，咖啡因，氯丙嗪，布洛芬，蒂巴因，四氫大麻酚，利多卡因，那可丁，阿普唑侖，福爾可啶，喃氟啶，苯噻啶，安定，三唑侖，比沙可啶，苯乙哌啶，硝苯啶，卡馬西平，硫唑嘌啶，阿托品，氨苯蝶啶，氟哌啶醇，甲磺酸雙麥角毒堿，丁丙諾啡，苯丙醇胺和苯乙胺共40種毒品和藥品。作為特異性檢測(cè)的干擾物質(zhì)，進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，本項(xiàng)目制備的毒品檢測(cè)芯片基本上未發(fā)生任何交叉反應(yīng)。特異性達(dá)到99%。

2.4 穩(wěn)定性

將毒品檢測(cè)芯片儲(chǔ)存在37℃下28d，并且信號(hào)強(qiáng)度在28d研究之前和之后各確定一次。結(jié)果顯示此種芯片可以在下37℃下28d。

3 討論

膜基片主要適用于制備陣列型的蛋白質(zhì)芯片，同時(shí)也適用于各種多肽、核酸、碳水化合物以及小分子化合物等各類生物信號(hào)分子的微陣列制備[4]?；瘜W(xué)膜的優(yōu)點(diǎn)在于不需要做點(diǎn)樣前的復(fù)雜表面處理，就可以進(jìn)行點(diǎn)樣，但容易造成較高的背景，降低檢測(cè)的靈敏性[5]。用噴墨打印頭將蛋白質(zhì)樣品噴點(diǎn)到固相介質(zhì)上形成陣列，可以通過(guò)電腦程序自動(dòng)精確控制，效率很高，能夠制備較高密度的蛋白質(zhì)芯片，是今后制作高密度蛋白質(zhì)芯片的主要方法。膜的參數(shù)可調(diào)節(jié)，如膜厚、生物信號(hào)分子的密度、功能基團(tuán)等?？筛鶕?jù)要求選擇基片。

制備微陣列的一個(gè)共同問(wèn)題是，每個(gè)分離測(cè)試區(qū)（DTR）分配液滴的干燥期間，會(huì)形成“環(huán)形污點(diǎn)”或者“圓形圖”。干燥期間會(huì)集中在液滴周圍形成圓環(huán)形的非特異性信號(hào)[6-7]。這些圓環(huán)形的點(diǎn)會(huì)在某種程度上影響檢測(cè)的精確性和重復(fù)性。在研制過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣所用的緩沖液的性質(zhì)是“環(huán)形污點(diǎn)”出現(xiàn)的關(guān)鍵因素，同時(shí)，點(diǎn)樣緩沖液也是決定DTR形狀和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。采用添加一定量的蔗糖和海藻糖（6%～20%）不會(huì)降低光信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)對(duì)包被的抗原具有極大的穩(wěn)定作用。

表2 芯片檢測(cè)常見(jiàn)的毒品種類和靈敏度 單位：（ng/ml）

表1 芯片檢測(cè)結(jié)果與GC-MS結(jié)果比較

封閉的目的是消除檢測(cè)中的非特異結(jié)合，提高檢測(cè)的信噪比。除此之外，封閉還可以有一定穩(wěn)定作用。本文中制備的芯片采用磷酸鹽緩沖液和3%小牛血清白蛋白，加入0.5%的Tween-20和0.5%PVA（Polyvinyl alcohol），具備良好的親水性，每個(gè)分離測(cè)試區(qū)（DTR）邊緣清晰，信號(hào)較強(qiáng)并且背景很低。

Cy5是目前常用的蛋白熒光標(biāo)記物，吸收/發(fā)射波長(zhǎng)為：650nm/667nm，為紅色熒光。具有背景低、靈敏度高的特點(diǎn)。我們采用CY5 NHS ester（羥基琥珀酰亞胺酯），與蛋白交聯(lián)效率高，操作簡(jiǎn)單，適合大批量制備。與目前有些蛋白芯片所使用的過(guò)氧化物酶的化學(xué)發(fā)光或顯色方法相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需顧及酶和底物的活性和污染問(wèn)題。

毒品芯片的檢測(cè)具有高通量、靈敏度和自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，可以根據(jù)自身的需求制備不同毒品種類的組合陣列芯片，對(duì)于芯片制作過(guò)程中每個(gè)步驟的精確控制，比如點(diǎn)樣過(guò)程中的量的控制，封閉過(guò)程的控制以及標(biāo)記效率的控制等，都是解決蛋白芯片批量生產(chǎn)中的批間差和批內(nèi)差的關(guān)鍵，本文所闡述的研究過(guò)程和結(jié)果是毒品芯片檢測(cè)試劑盒的前期數(shù)據(jù)，要制備出產(chǎn)品化的毒品芯片檢測(cè)試劑盒，還必須制定一整套生產(chǎn)和質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)方法，以滿足實(shí)際應(yīng)用的需求。

[1]de Wildt R M T，et al.Antibody arrays for high-throughput screening of antibody-antigen intractions[J].Nature Biotechnol，2000，18：989.

[2]Stahler P.Microarray technology：an array of opportunities[J]. Nature，2002，416：85-91.

[3]Hongwu Du，Moutian Wu，Weiping Yang，Gu Yuan.Development of Miniaturized Competitive Immunoassays on a Protein Chip as a Screening Tool for Drugs[J].Clinical Chemistry，2005，51（2）：368-375.

[4]Birchard K.Past，present，and future of drug abuse at the Olympics[J].Lancet 2000,356：1008.

[5]Ge H.UPA，a universal protein array system for quantitative detection of protein-protein，protein-DNA，protein-RNA and protein-ligand interactions[J].Nucl Acids Res，2000,28：e3，1.

[6]FitGerald，S.P.，Lamont，J.V.，McConell，R.I.and Benchikh，E.O.Development of a high-throughput automated analyzer using biochip array technology[J].Clin.Chem，2005，51（7）：1165-1176.

[7]Molloy，R.M，McConnell，R.I.，Lamont，J.V.and FitGerald，S.P.Automation of biochip array technology for quality results. Clin.Chem[J].Lab.Med，2005，43（12）：1303-1313.