高效液相色譜法測(cè)定葉酸水解制備蝶酸的含量*

張 許 劉 衛(wèi)

(1.泰山醫(yī)學(xué)院，山東 泰安 271016； 2.中國(guó)人民解放軍第八十八醫(yī)院，山東 泰安 271000)

蝶酸是葉酸結(jié)構(gòu)的一部分。曹曦元等[1]曾報(bào)道蝶酸能拮抗蓖麻毒素(Ricin)A鏈蛋白，常作為陽性對(duì)照藥研究化合物拮抗蓖麻毒素A鏈蛋白的作用。蓖麻毒素A鏈蛋白具有很強(qiáng)的抑制蛋白質(zhì)合成的功能，是一種生化武器，目前臨床沒有有效的解毒劑，而其原料獲得和提取、純化工藝都不復(fù)雜[2-3]。所以，研究蓖麻毒素解毒劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究利用葉酸水解實(shí)驗(yàn)制備得到蝶酸粗品，初步精制后建立其含量測(cè)定方法，為今后的實(shí)驗(yàn)提供原料。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 Lablliance高效液相色譜儀，Scientific System,Inc；配有二級(jí)陣列管UV6000LP型紫外檢測(cè)器，Scientific System,Inc；BT124S型電子天平，北京多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；甲醇為色譜純；鹽酸、冰醋酸、三乙胺、氨水均為分析純；蝶酸對(duì)照品(≥93%)，購(gòu)自Sigma公司；蝶酸供試品為本實(shí)驗(yàn)室用葉酸水解制得。

1.2葉酸水解試驗(yàn)

1.2.1試驗(yàn)原理 酰胺水解有兩種方法，一是酸堿催化，在pH=3或者pH﹥13的條件下可以水解。二是用酰胺水解酶。本實(shí)驗(yàn)采用酸性條件下水解。

1.2.2試驗(yàn)步驟 葉酸45 g加蒸餾水300 ml，加HCl溶解成褐色澄清溶液，控制pH值3左右，攪拌加熱至80～90℃，水解2.5 h。冷卻至室溫，抽濾得產(chǎn)物晾干，稱重。將第一步水解產(chǎn)物溶于氨水，加少量活性炭煮沸10 min脫色，抽濾，濾液加HCl調(diào)pH值至弱酸性，冷卻至室溫。抽濾得產(chǎn)物，晾干。

1.3色譜條件 色譜柱：PhenomexneC18(250 mm×4.6 mm)，流動(dòng)相甲醇︰水(含2%醋酸、0.2%三乙胺)為25︰75，流速1 ml/min。樣品溶劑為0.375%氨水。波長(zhǎng)：285 nm。

1.4對(duì)照品及樣品制備 準(zhǔn)確稱取10 mg蝶酸對(duì)照品，用0.375%氨水溶解于50 ml容量瓶并定容至刻度，搖勻得0.2 mg/ml對(duì)照品。臨用前稀釋至所需濃度，進(jìn)樣20 μl，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。準(zhǔn)確稱取樣品50 mg。用0.375%氨水溶解于50 ml容量瓶并定容至刻度，搖勻得1 mg/ml。臨用前稀釋至所需濃度，進(jìn)樣20 μl，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.5計(jì)算方法 采用外標(biāo)法測(cè)定蝶酸含量，根據(jù)公式：m待測(cè)物=A待測(cè)物×m標(biāo)準(zhǔn)物/A標(biāo)準(zhǔn)物。所以其含量為：m待測(cè)物/m樣品進(jìn)樣量×100%。A為峰面積，m為藥物質(zhì)量。

2 結(jié)果與計(jì)算

2.1色譜分離 二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)譜圖顯示在285 nm處有最大吸收，選用本色譜條件，分析效果和保留時(shí)間都比較理想(圖1～3)。

圖1 二極管陣列全波長(zhǎng)掃描圖

圖2 蝶酸粗品

圖3 蝶酸標(biāo)準(zhǔn)品

2.2線性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 ml, 置50 ml量瓶中，用0.375%氨水溶解并定容, 搖勻，得1.6，3.2，4.8，6.4，8，9.6 μg/ml溶液。在上述色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定, 記錄色譜圖。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程,結(jié)果見圖4。

圖4 蝶酸線性方程標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程為:y=463589x + 52911，相關(guān)系數(shù)為r=0.9991，表明蝶酸在1.6～9.6 μg濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3精密度試驗(yàn) 吸取對(duì)照品溶液8 μg/ml和4 μg/ml按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20 μl，結(jié)果見表1，RSD分別為1.15%和1.73%。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品配制成濃度為20 μg/ml的溶液按上述色譜條件分別在0，2，4，6，8，10，12小時(shí)進(jìn)樣，結(jié)果見表2，RSD= 0.42%，結(jié)果表明蝶酸在12小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5含量測(cè)定 取8 μg/ml和4 μg/ml的蝶酸標(biāo)準(zhǔn)液，各自峰面積平均值為A1標(biāo)準(zhǔn)物和A2標(biāo)準(zhǔn)物，20 μg/ml的樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)平均值為A待測(cè)物，根據(jù)公式測(cè)得蝶酸含量為72.5%和73.5%。取平均值73%。

2.6加樣回收率試驗(yàn) 稱取粗品6份，分別加入3 mg蝶酸標(biāo)準(zhǔn)品，按樣品溶液制備方法操作得加樣回收溶液，按上述色譜條件操作進(jìn)樣，結(jié)果見表3，平均回收率為98.9%，結(jié)果表明本方法回收率較高。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

蝶酸由于其溶解性不好，限制了其開發(fā)利用[4]，所以現(xiàn)在多用于做對(duì)照品，目前也沒有報(bào)道改變其溶解度的研究，可能因?yàn)榈嵩谑忻嫔想y以購(gòu)買。本實(shí)驗(yàn)用葉酸水解制備蝶酸得到的粗品，操作步驟簡(jiǎn)單，試劑成本低，適用于實(shí)驗(yàn)室小量合成，雖然純度不高，根據(jù)需要再進(jìn)一步純化基本能滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。含量測(cè)定方法參考葉酸的標(biāo)準(zhǔn)，但大部分葉酸的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)都采用磷酸鹽為流動(dòng)相，其配置和沖洗色譜柱的過程繁瑣，且對(duì)色譜柱的損害也比不含鹽的流動(dòng)相損害嚴(yán)重，本實(shí)驗(yàn)采用的流動(dòng)相簡(jiǎn)單易配置，省時(shí)省力又延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)證實(shí)靈敏度高，選擇性好，無干擾，結(jié)果令人滿意。

[1] 曹曦元，趙青，黎燕，等. 蝶酸對(duì)天然蓖麻毒素及重組蓖麻毒素A鏈蛋白的拮抗作用研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2010，34(1)：12-15.

[2] 鄭成，雷德柱，雷雨，等. 蓖麻毒蛋白提取[J].廣東化工，2003(5):1-4.

[3] 余濤，唐吉軍，郝蘭群，等. 一種純化蓖麻毒素的新方法[J].生物技術(shù)，2005，15(5)：53-55.

[4] Yan X, Hollis T, Svinth M, et al. Structure-based identification of a ricin inhibitor[J]. J Mol Biol, 1997, 266(5):1043-1049.