單核細(xì)胞趨化蛋白-1啟動基因多態(tài)性與狼瘡腎炎相關(guān)性的研究*

武樹朋 李 芳 王 靜 張源潮

(1泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,山東 泰安 271000； 2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250012 )

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是以引起抗體過度產(chǎn)生、補(bǔ)體異?；罨?、免疫復(fù)合物病理沉積、免疫功能持續(xù)紊亂為特征的多系統(tǒng)、多器官損害的自身免疫性疾病。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)是β類趨化因子，其功能為趨化白細(xì)胞及其它介質(zhì)進(jìn)入炎癥部位[1]。位于MCP-1-2518部位的基因多態(tài)性影響轉(zhuǎn)錄的活性[2]。在狼瘡腎炎(LN)活動期患者，位于腎小球和腎小管處MCP-1的表達(dá)數(shù)量是增加的，而其尿液MCP-1的水平也增加[3]。在本研究中，對于MCP-1 -2518位點(diǎn)基因多態(tài)性與SLE患者發(fā)生狼瘡腎炎危險性進(jìn)行了檢測。

1 材料和方法

1.1研究對象 收集2005年6月～2006年2月在山東省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診就診或住院SLE患者72例，所有患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1997年修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)[4]。在確診為SLE的基礎(chǔ)上如有持續(xù)性蛋白尿>0.5 g/d或多次尿蛋白≥3+，或(和)細(xì)胞管型尿(可為紅細(xì)胞、血紅蛋白、顆?；蚧旌瞎苄?，則可診斷為狼瘡腎炎[5]。根據(jù)SLE疾病活動指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)來評價患者的病情活動性[6]。健康對照組為來自山東省立醫(yī)院健康查體中心健康體檢者59例。

1.2研究方法

1.2.1外周血基因組DNA提取 從經(jīng)過EDTA處理全血中獲得的外周白細(xì)胞抽提基因組DNA,該過程按照外周血基因組DNA抽提試劑盒操作說明進(jìn)行。DNA抽提試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 查閱相關(guān)文獻(xiàn)及與GeneBank核對序列，設(shè)計合成MCP-1啟動基因PCR反應(yīng)引物[7]，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。序列如下： 正向引物 5’-CCGAGATGTTCCCAGCACAGC-3’，反向引物 5’-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3’ 。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃1 min、55℃1 min、72℃1.5 min循環(huán)35次，隨后在72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)試劑購自寶生物工程公司。

1.2.3限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PvuII限制性內(nèi)切酶(晶美生物工程公司)在37℃消化16 h。酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)凝膠顯像系統(tǒng)顯像并分析結(jié)果。

1.2.4基因型的判定 含有單一930 bp片段的樣本基因型為A/A，含有930、708、222 bp三種片段的樣本基因型為A/G，含有708、222 bp兩種片段的樣本基因型為G/G。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料用相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1實驗組與對照組的均衡性檢驗(表1) 納入本研究的SLE患者組72例，其中女性65例，男性7例，年齡(33.50±12.39)歲；對照組59例，其中女性53例，男性6例，年齡(33.20±11.68)歲。兩組性別構(gòu)成、年齡構(gòu)成經(jīng)χ2檢驗無顯著性差異(P=0.932、P=0.840)，兩組平均年齡經(jīng)t檢驗顯示無顯著性差異(P=0.889)，表明本研究SLE患者組及對照組在性別及年齡上具有可比性。

2.2MCP-1 -2518位點(diǎn)基因突變PCR-RFLP電泳結(jié)果(圖1) 野生型(A/A)不被限制性內(nèi)切酶PvuII所酶切，顯示為930bp一條帶；同源突變型(G/G)被PvuII酶切為708、222bp兩片段，顯示為兩條帶；雜合突變型(A/G)被PvuII酶切為930、708、222bp三片段，顯示為三條帶。

表1 兩組研究對象的臨床資料分析

圖1 MCP-1-2518酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3MCP-1-2518位點(diǎn)基因型在SLE患者組及對照組中的分布(表2) 對照組A/A型基因型頻率顯著高于SLE患者組(P=0.001)。A/G型(P=0.024) 和G/G型(P=0.020)多見于SLE患者。

2.4MCP-1-2518位點(diǎn)基因型在狼瘡腎炎及無狼瘡腎炎SLE患者中的分布(表3) 與無狼瘡腎炎SLE患者相比，患狼瘡腎炎的SLE患者較常見基因型為A/G(P=0.024) 和G/G(P=0.015)。

表2 MCP-1-2518位點(diǎn)基因型在兩組中的分布

表3 MCP-1-2518位點(diǎn)基因型在SLE患者中的分布

3 討 論

SLE是由于遺傳、激素、環(huán)境等多因素相互作用引起機(jī)體免疫調(diào)節(jié)紊亂所致的一種自身免疫性疾病。自Biett 1882年最早描述SLE至今，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚。近年來,自從趨化因子受體被發(fā)現(xiàn)作為HIV感染的協(xié)同受體后[8],趨化因子研究領(lǐng)域引起廣泛的關(guān)注。而有研究[9]表明,HIV感染與SLE的免疫學(xué)以及臨床上有很大的相似。這就很自然的使人聯(lián)想到,與HIV感染有關(guān)的化學(xué)趨化因子可能與SLE發(fā)病或臨床有關(guān)。

MCP-1 是由內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC) 、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCS)和單核細(xì)胞(monocytes,MCS) / 巨噬細(xì)胞分泌的一種趨化因子,屬于趨化因子超家族。多種類型細(xì)胞包括血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均可接受炎癥細(xì)胞因子例如IL-1 、TNF-α和IFN-γ和免疫復(fù)合物的刺激而表達(dá)MCP-1[10]。MCP-1 不僅是一種單核細(xì)胞趨化因子,在單核細(xì)胞上有MCP-1 的高度特異性受體[11],而且可以趨化T 淋巴細(xì)胞,MCP-1 趨化的T淋巴細(xì)胞表現(xiàn)型為記憶型, 產(chǎn)生應(yīng)答的細(xì)胞目前發(fā)現(xiàn):CD45RA-,CD45RO+,CD8+[12],MCP-1 能呈劑量依賴性誘導(dǎo)人外周血MC 表達(dá)組織因子[13]。MCP-1 能誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子,粘附分子可促進(jìn)單核細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的粘附并向內(nèi)皮下遷移。MCP-1 能誘導(dǎo)白介素的表達(dá)[14]。MCP-1 還能誘導(dǎo)單核細(xì)胞鈣離子內(nèi)流,引起呼吸爆發(fā)、氧自由基的大量釋放,導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度也能影響單核細(xì)胞向內(nèi)皮下遷移。因此,MCP-1 對單核細(xì)胞內(nèi)皮下的募集起到啟動和放大作用。

MCP-1多態(tài)性在SLE的作用已經(jīng)有許多研究者予以檢測，但卻得出不同的結(jié)論。本研究顯示MCP-1-2518位點(diǎn)基因型為A/G或G/G型的SLE患者有患狼瘡腎炎的3～6倍高危險性，而基因型為A/A 型的SLE患者則具有較低的患狼瘡腎炎的危險性。該研究得出的結(jié)論與美國研究人員Marco Tucci等[7]報道一致。然而，西班牙研究人員對SLE病人的檢測，A/G基因型與血管炎的發(fā)生有關(guān)，但與狼瘡腎炎的發(fā)生發(fā)展無關(guān)聯(lián)性[15]，很可能是該研究中研究樣本的民族組成與我們研究的不同導(dǎo)致的。韓國人Kim HL等[16]的研究發(fā)現(xiàn)A/A基因型的SLE病人具有較高的尿MCP-1水平，而且該基因型的狼瘡腎炎病人具有較差的預(yù)后，而所有其他研究人員對于MCP-1 -2518位點(diǎn)基因多態(tài)性的檢測顯示A/G或G/G基因型的被研究者具有較高的血或尿MCP-1水平，只能推測在韓國人群中還有其他的基因突變影響MCP-1。Tucci M等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，臺灣地區(qū)兒童群體系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生發(fā)展與 MCP-1-2518基因突變不存在相關(guān)性，而與同為CC類趨化因子的RANTES(reduced upon activation,normal T expressed secreted;正常T細(xì)胞表達(dá)、分泌、活化時表達(dá)下降的因子)存在相關(guān)性。為進(jìn)一步確證MCP-1-2518位點(diǎn)基因多態(tài)性在SLE 發(fā)病中的作用還應(yīng)擴(kuò)大樣本量,從不同的實驗角度論證。

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