鼻咽癌組織中上皮-間葉轉(zhuǎn)換的檢測及與其轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

羅愛華 高 嵋 謝 樂 黃卓雅 李飛虹 蔡瓊珍 姜漢國

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)在全世界內(nèi)流行，特別是中國南方如廣東、廣西、香港多見，與EB病毒感染密切相關(guān)[1,2]，大約60%的患者是在頸部淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移后，因頸部腫物而就診，經(jīng)臨床穿刺或活檢證實后已屬晚期。放療和化療的聯(lián)合應(yīng)用是NPC的常規(guī)治療方法，雖然部分患者對放療敏感，但仍約有40%～60%的鼻咽癌患者因遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)及放化療副作用等原因?qū)е滤劳?，其中最為重要的是NPC的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，研究其轉(zhuǎn)移的機(jī)制一直是鼻咽癌基礎(chǔ)和臨床上一個非常重要的課題之一。

雖然目前惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移機(jī)制仍不完全清楚，但得到共識的是惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移包括多個步驟和環(huán)節(jié)[3]。近年來，一些研究提示腫瘤的上皮-間葉轉(zhuǎn)換(EMT)與一些腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4～7]。為觀察是否鼻咽癌具有EMT樣作用及其與轉(zhuǎn)移的關(guān)系，我們應(yīng)用免疫組化法，檢測130例鼻咽未分化型非角化性癌中Vimentin和E-cadherin(E-cd)的表達(dá)，旨在探討它們與鼻咽癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本 收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院和附屬高州人民醫(yī)院2004年～2007年收治的鼻咽癌患者130例，其中男性76例，女性54例，中位年齡47歲，檢測前未經(jīng)過任何放療和化療，按WHO分類均為未分化型非角化性癌，其中53例經(jīng)活檢、細(xì)胞學(xué)穿刺和免疫組化檢查證實頸部淋巴結(jié)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，內(nèi)有23例為配對淋巴結(jié)鼻咽癌轉(zhuǎn)移，其余77例病理檢查確診鼻咽癌時影像學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)局部浸潤、轉(zhuǎn)移性病變和腫大的淋巴結(jié)。

1.1.2 試劑及抗體 鼠抗人Vimentin和E-cadherin單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒均購于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 HE染色 常規(guī)HE染色，鼻咽癌分別按WHO分型及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分組。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 免疫組化按SP試劑盒說明書進(jìn)行操作。由試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為空白對照。

1.3 結(jié)果判斷

Vimentin 陽性表達(dá)均定位于細(xì)胞質(zhì)，E-cadherin陽性表達(dá)定位于細(xì)胞膜，陽性表達(dá)均呈棕黃色或棕褐色顆粒樣分布。由兩人分別獨立對實驗結(jié)果進(jìn)行雙盲法評估。每一切片隨機(jī)選擇5個視野(×100)，在顯微鏡(×400)下計數(shù)每個視野100個腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞比例，非癌組織則計數(shù)著色區(qū)100個細(xì)胞中陽性細(xì)胞比例，取5個視野的平均百分?jǐn)?shù)為判定結(jié)果。光學(xué)顯微鏡下觀察，根據(jù)棕黃色陽性信號的強(qiáng)弱和面積判斷結(jié)果：陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性表達(dá)；10%～50%為陽性表達(dá)；>50%為強(qiáng)陽性表達(dá)。結(jié)果判斷，①按陽性細(xì)胞百分率計分：陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分；11%～50%為1分；>50%為2分。②按染色強(qiáng)弱計分：淡黃色為0分；黃色為1分；棕黃色為2分。兩項分?jǐn)?shù)相加得0～1分為陰性；2～3分為陽性；4分為強(qiáng)陽性；0分和1分為-；2分為+；3分為++；4分為+++。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)資料統(tǒng)計采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS for Window 11.0(SPSS Inc.,U.S.A)做四格表的卡方檢驗，Spearman相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌轉(zhuǎn)移組和非轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)情況

鼻咽癌轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組中E-cadherin和Vimentin陽性表達(dá)率分別為62.3%(33/53)、60.4%(32/53)和84.4%(65/77)、27.3%(21/77)。轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組E-cadherin 和Vimentin表達(dá)比較有顯著性差異(P<0.01)；鼻咽癌轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組相比，Vimentin陽性表達(dá)水平明顯上調(diào)，而E-cadherin陽性表達(dá)水平則明顯下調(diào)，見表1。

2.2 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌原發(fā)灶及其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況

鼻咽癌原發(fā)灶及其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E-cadherin和Vimentin陽性表達(dá)率分別為78.3%(18/23)、65.2%(15/23)和47.8%(11/23)、30.4%(18/23)。E-cadherin和Vimentin陽性表達(dá)率鼻咽癌原發(fā)灶與其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶比較有顯著性差異(P<0.05)，鼻咽癌原發(fā)灶與其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶相比，E-cadherin陽性表達(dá)水平明顯下降，其中表達(dá)缺失相對少見，大部分為異常表達(dá)即由胞膜定位轉(zhuǎn)變?yōu)榘|(zhì)內(nèi)表達(dá)，鼻咽癌原發(fā)灶內(nèi)Vimentin陽性表達(dá)較多見，主要見于梭形癌細(xì)胞和少數(shù)上皮樣癌細(xì)胞，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Vimentin陽性表達(dá)水平下調(diào)，多見于梭形癌細(xì)胞和少數(shù)上皮樣癌細(xì)胞，而泡狀核癌細(xì)胞一般呈陰性表達(dá)，見表1。

表1 E-cadherin和Vimentin在鼻咽癌、原發(fā)灶及其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況(例，%)

注：▲為與轉(zhuǎn)移組比較，P<0.01；*為與原發(fā)灶比較，P<0.05

2.3 鼻咽癌中Vimentin與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

鼻咽癌轉(zhuǎn)移組中，Vimentin與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，Spearman相關(guān)分析結(jié)果為:γ=-0.448，P=0.001，見表2。

表2 鼻咽癌轉(zhuǎn)移組中Vimentin和E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

鼻咽癌非轉(zhuǎn)移組中，Vimentin與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性，Spearman相關(guān)分析結(jié)果為：γ=-0.356，P=0.001，見表3。

表3 非轉(zhuǎn)移組中Vimentin與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

2.4 鼻咽癌原發(fā)灶及其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Vimentin與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性分析

在鼻咽癌原發(fā)灶中，Vimentin與E-cadherin表達(dá)無相關(guān)性，Spearman相關(guān)分析結(jié)果為：γ=-0.010，P=0.963，見表4。在鼻咽癌配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，Vimentin與E-cadherin表達(dá)無相關(guān)性，Spearman相關(guān)分析結(jié)果為：γ=0.228，P=0.296，見表5。

表4 鼻咽癌原發(fā)灶中Vimentin與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

表5 鼻咽癌配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中Vimentin和E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

EMT是近年研究腫瘤轉(zhuǎn)移的一個熱點，而EMT與黏附分子功能的改變密切相關(guān)[5,8]。 EMT是指上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，在此過程中上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-間質(zhì)之間的黏附性發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白重排，最終細(xì)胞獲得更強(qiáng)的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。現(xiàn)在多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，EMT是上皮源性腫瘤轉(zhuǎn)移最為關(guān)鍵的步驟和非常重要的條件[9～11]。在EMT過程中，上皮性腫瘤細(xì)胞最主要的表型變化是向間葉轉(zhuǎn)換，其中最常應(yīng)用和公認(rèn)的指標(biāo)是檢測其E-cadherin和Vimentin表達(dá)的情況[12～14]。

E-cadherin是1種分子量為120 kD的跨膜單鏈多肽糖蛋白，其胞質(zhì)內(nèi)羧基端與α-、β-、和γ-連還素(catenins)形成E-cad/cat復(fù)合體，然后此復(fù)合體與細(xì)胞內(nèi)肌動蛋白微絲系統(tǒng)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系，通過介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與調(diào)節(jié)組織發(fā)生與形態(tài)分化，對細(xì)胞的識別、遷移等行為發(fā)揮非常重要的作用。任何因素改變E-cad/cat復(fù)合體中各個成分的表達(dá)、結(jié)構(gòu)或破壞復(fù)合體與細(xì)胞骨架連接，都會導(dǎo)致E-cad/cat復(fù)合體功能的下降或喪失，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附性下降，最后引起細(xì)胞的分離和移動。目前很多研究揭示，E-cad表達(dá)下調(diào)或缺失是導(dǎo)致惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一[15]。除了E-cad表達(dá)下調(diào)可影響E-cad/cat復(fù)合體的功能，E-cad表達(dá)部位也與其功能密切相關(guān)：因E-cad是Ca2+依賴性的，當(dāng)Ca2+濃度下降時，不僅使Ca2+胞外5個重復(fù)系列的構(gòu)型發(fā)生改變，蛋白酶作用位點曝露，以致膜上E-cad被降解，而且可使細(xì)胞內(nèi)骨架成分如肌動蛋白等成分在細(xì)胞內(nèi)重新分布，從細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，E-cad的不能定位于細(xì)胞膜而喪失其介導(dǎo)細(xì)胞黏附的功能，使細(xì)胞之間變的松散。

除了具有重要黏附分子的功能以外，最近研究還發(fā)現(xiàn)E-cad/cat與腫瘤的上皮-間葉轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transtition,EMT)密切相關(guān)[5,8]。在我們130例鼻咽未分化型非角化性癌的病例中，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中Vimentin陽性表達(dá)率明顯高于非轉(zhuǎn)移組，兩組比較在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異，這說明鼻咽癌表型的改變即具有某些間葉特征的腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生轉(zhuǎn)移。未分化型非角化性癌占所有的鼻咽癌90%以上，其中形態(tài)呈梭形的又占有相當(dāng)?shù)谋壤糠植±@示上皮樣與梭形混合存在，是一個非常典型的具有異質(zhì)性的惡性腫瘤。我們研究發(fā)現(xiàn)呈梭形的鼻咽癌細(xì)胞Vimentin的陽性表達(dá)較強(qiáng)，往往呈片塊狀陽性，而上皮樣的癌細(xì)胞Vimentin陽性表達(dá)較弱，往往顯示點灶狀陽性，有時在部分區(qū)域的可以看到2種形態(tài)癌細(xì)胞并存，其Vimentin陽性表達(dá)會顯示明顯的差異性，表現(xiàn)為梭形的癌細(xì)胞陽性表達(dá)往往強(qiáng)于其臨近的上皮或泡狀核癌細(xì)胞，以上的形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)結(jié)果，支持了部分上皮源性惡性腫瘤向間葉轉(zhuǎn)化的假說，同時也揭示EMT樣改變與鼻咽癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這與一些學(xué)者在其它上皮上皮源性惡性腫瘤觀察的結(jié)果是相吻合的[16～18]。為了進(jìn)一步證實鼻咽癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移與細(xì)胞黏附分子缺失和間葉轉(zhuǎn)換間的關(guān)系，我們對23例鼻咽癌原發(fā)灶和其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶同時進(jìn)行E-cadherin和Vimentin免疫組織化學(xué)染色，免疫組化結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中E-cadherin陽性表達(dá)水平明顯低于其相對應(yīng)的鼻咽癌原發(fā)灶，表達(dá)完全缺失相對少見，大部分陽性為異常表達(dá)即胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，這說明在轉(zhuǎn)移過程中，E-cad的構(gòu)型發(fā)生了改變，蛋白酶作用位點曝露，以致膜上E-cad被降解，而且可能使細(xì)胞內(nèi)骨架成分如肌動蛋白等成分在細(xì)胞內(nèi)重新分布，從細(xì)胞膜進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，E-cad的不能定位于細(xì)胞膜而導(dǎo)致cad/cat復(fù)合體功能的障礙影響了細(xì)胞黏附功能，使細(xì)胞之間變松散。同時，我們也觀察到鼻咽癌原發(fā)灶中Vimentin陽性表達(dá)水平明顯高于其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，并具有顯著性差異，說明在轉(zhuǎn)移最初階段Vimentin發(fā)揮重要作用，同樣，Vimentin陽性也預(yù)示其轉(zhuǎn)移的可能性增加，這與有些學(xué)者觀察的結(jié)果相吻合[16]。引起這種Vimentin改變機(jī)制有許多假說和理論，但目前仍然不完全清楚，不同的學(xué)者通過研究不同的樣本得出不同的結(jié)論[19～22]。有學(xué)者研究顯示鼻咽癌的EMT與EB病毒感染密切相關(guān)[23]。

通過Spearman相關(guān)分析我們發(fā)現(xiàn)，在未分化型非角化性癌淋巴結(jié)非轉(zhuǎn)移組中，Vimentin蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為Vimentin蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，而E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。而在轉(zhuǎn)移組中，Vimentin蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表現(xiàn)為Vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，這說明Vimentin與E-cadherin表達(dá)密切相關(guān)，而23例未分化型非角化性癌原發(fā)灶與其配對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，Vimentin蛋白表達(dá)與E-cadherin蛋白表達(dá)Spearman相關(guān)分析結(jié)果揭示了同樣的趨勢，但在統(tǒng)計學(xué)方面無相關(guān)性，這可能與我們收集的樣本數(shù)量過少有關(guān)。

總之，我們的研究提示，鼻咽未分化型非角化性癌具有EMT樣作用，同時其EMT與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這為以后研究腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的機(jī)制及其防治提供新的思路。

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