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    索拉非尼對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響

    2012-01-08 12:08:03余進(jìn)進(jìn)黃小艷楊文霞王會平
    實(shí)用癌癥雜志 2012年1期
    關(guān)鍵詞:索拉非尼藥組紫杉醇

    潘 敏 余進(jìn)進(jìn) 黃小艷 楊文霞 王會平

    索拉非尼是首個(gè)口服的小分子多靶點(diǎn)抗腫瘤藥物,不僅可以抑制RAF 激酶,還能抑制血管內(nèi)皮生長因子 -2(VEGFR-2)、血管內(nèi)皮生長因子 - 3(VEGFR-3)以及血小板源生長因子-β(PDGFR-β )的酪氨酸激酶的活性,通過雙重機(jī)制抑制腫瘤生長,被稱為多激酶抑制劑[1]。本實(shí)驗(yàn)研究索拉非尼與紫杉醇單獨(dú)給藥及兩藥不同給藥順序聯(lián)合給藥,對人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響,為動物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株由無錫市第四人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存;RPMI-1640、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒、Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒均購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清購自杭州四季青生物公司;實(shí)驗(yàn)藥物索拉非尼為德國拜耳公司產(chǎn)品。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新生牛血清及青、鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3天換液1次,待細(xì)胞鋪滿瓶底70%~80%時(shí),用0.25%胰蛋白酶消化、傳代繼續(xù)培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 MTT檢測索拉非尼作用于人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株的抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞,以最適密度(5 000個(gè)/100 μL)接種于 96孔板,置于37℃含5%CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,吸盡培養(yǎng)基,PBS洗兩遍,加入稀釋成不同濃度的藥物各100 μL,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)中止前4 h每孔加入50 μL的1×MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸盡上清液,每孔加入DMSO 150 μL,微振蕩器上振蕩溶解10 min,以空白對照孔調(diào)零,在自動酶標(biāo)儀490 nm波長處,測定每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞抑制率(%)= 1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值) ×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.2.3 Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞,以最適濃度接種于96孔板,設(shè)陰性對照組及索拉非尼處理組(加藥濃度為3.0、6.0、12.0 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,棄上清,加入適量Hoechst33258染液,室溫避光反應(yīng)10 min,于熒光倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

    1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期及凋亡率變化 取對數(shù)生長期細(xì)胞,以50萬個(gè)/mL的濃度分別接種于100 ml的培養(yǎng)瓶中,共6組。①空白對照組:不加任何藥物,培養(yǎng)細(xì)胞48 h;②索拉非尼組:單獨(dú)用索拉非尼6 μmol/L,作用細(xì)胞24 h;③紫杉醇組:單獨(dú)用紫杉醇 0.008 μmol/L,作用細(xì)胞24 h;④索拉非尼序于紫杉醇組:先用索拉非尼作用細(xì)胞24 h,然后加入紫杉醇繼續(xù)作用細(xì)胞24 h;⑤紫杉醇序于索拉非尼組:先用紫杉醇作用細(xì)胞24 h,然后加入索拉非尼繼續(xù)作用細(xì)胞24 h;⑥索拉非尼和紫杉醇同時(shí)給藥組:同時(shí)用索拉非尼和紫杉醇作用細(xì)胞24 h。各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)藥物處理后,用胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,按流式細(xì)胞檢測試劑盒說明書處理細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 索拉非尼作用于SKOV-3細(xì)胞株的抑制率

    不同濃度、不同時(shí)間索拉非尼對SKOV-3細(xì)胞的抑制作用見圖1。索拉非尼對SKOV-3細(xì)胞有明顯抑制作用,且這種抑制作用隨著其濃度增高或作用時(shí)間延長而增強(qiáng),呈顯著劑量和時(shí)間依賴性(P<0.05)。

    圖1 不同濃度索拉非尼對SKOV-3細(xì)胞增殖抑制作用

    2.2 Hoechst染色法觀察細(xì)胞凋亡情況

    不同濃度索拉非尼處理細(xì)胞后,經(jīng)Hoechst33258染色,熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),正常對照組細(xì)胞的胞核熒光分布較均勻,呈淺藍(lán)色熒光;而索拉非尼處理24 h后的細(xì)胞,則出現(xiàn)不同程度核固縮、碎裂,形態(tài)不規(guī)則,并見凋亡小體,鏡下呈明亮藍(lán)色熒光,即典型細(xì)胞凋亡形態(tài),其中索拉非尼濃度為12.0 μmol/L時(shí)較為明顯。

    2.3 細(xì)胞周期及凋亡率變化

    流式細(xì)胞儀檢測索拉非尼、紫杉醇單獨(dú)給藥及兩藥不同順序聯(lián)合給藥,對SKOV-3細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡率的影響。索拉非尼主要使細(xì)胞阻滯在S期,6個(gè)實(shí)驗(yàn)組中,給藥組凋亡率均高于對照組,而其中以紫杉醇序于索拉非尼組凋亡率最高[(27.57±2.01)%],顯著高于其他各組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而索拉非尼序于紫杉醇組的凋亡率[(9.73±1.15)%],明顯低于紫杉醇序于索拉非尼組及兩藥同時(shí)加入組,但高于單獨(dú)給藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1和圖2。

    3 討論

    RAF/MEK/ERK 信號傳導(dǎo)通路是細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖和分化過程中的主要途徑,RAF為該通路中的關(guān)鍵激酶,與細(xì)胞增殖、分化及血管生成的調(diào)節(jié)密切相關(guān),索拉非尼正是通過抑制RAF活性從而阻斷了RAF/MEK/ERK 信號傳導(dǎo)通路,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,并且誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。另一方面,腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成,VEGF和 PDGF是重要的促血管生成因子,索拉非尼通過抑制VEGFR-2、 VEGFR-3和PDGFR 酪氨酸激酶的活性,阻斷腫瘤血管生成,抑制腫瘤生長[1]。一些臨床研究顯示,索拉非尼在肝細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的治療中顯示了良好效果[2~4]。在慢性粒細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤等人類腫瘤的臨床前研究顯示,索拉非尼能顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系[5~7]。Noriomi等在卵巢透明細(xì)胞癌的裸鼠移植瘤模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,索拉非尼能顯著抑制移植瘤的生長,且裸鼠體重?zé)o明顯影響,提示該藥對其無明顯毒性作用[8]。

    表1 各組細(xì)胞周期及凋亡情況

    圖2 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡情況

    本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測索拉非尼與紫杉醇不同給藥方式對SKOV-3細(xì)胞細(xì)胞周期及凋亡率的影響,結(jié)果顯示聯(lián)合給藥組的凋亡率均高于單獨(dú)給藥組及對照組,其中紫杉醇序予索拉非尼組凋亡率最高,而索拉非尼序予紫杉醇組的凋亡率明顯低于紫杉醇序予索拉非尼組及同時(shí)加入兩藥組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在細(xì)胞周期的分析中發(fā)現(xiàn),索拉非尼使細(xì)胞阻滯在S期,使大部分細(xì)胞不能進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期,從而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,與紫杉醇聯(lián)合給藥組中,發(fā)現(xiàn)各組的 G0/G1期細(xì)胞均呈不同程度減少,索拉非尼序予紫杉醇組S期顯著增加,G2期相對減少,可能與S期阻滯,不能進(jìn)入G2期有關(guān),紫杉醇序予索拉非尼組及同時(shí)加入兩藥組,S期和G2/M期增加,其中,后予索拉非尼組凋亡率最高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此推測,先予化療藥物的誘導(dǎo)后序予索拉非尼治療卵巢癌可能獲得理想的效果。

    綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過 MTT法發(fā)現(xiàn)索拉非尼顯著抑制SKOV-3細(xì)胞的增殖,且其抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性,Hoechst染色法及流式細(xì)胞儀檢測進(jìn)一步證實(shí)索拉非尼能誘導(dǎo)SKOV-3細(xì)胞凋亡,在與卵巢癌一線化療藥物紫杉醇的聯(lián)合用藥中,發(fā)現(xiàn)先給予紫杉醇誘導(dǎo)后再予索拉非尼能夠獲得更高的凋亡率,提示在卵巢癌的臨床治療中,先予周期性化療誘導(dǎo),再序貫給予分子靶向治療藥物可能是治療卵巢癌的最佳模式。

    [1] Adnane L,Trail PA,Taylor I,et al.Sorafenib(BAY 43-9006,Nexavar),a dual-action inhibitor that targets RAF/MEK/ERK pathway in tumor cells and tyrosine kinases VEGFR/PDGFR in tumor vasculature〔J〕.Methods Enzymol,2006,407:597.

    [2] Llovet JM,Ricci S,Mazzaferro V,et al.Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma〔J〕.N Engl J Med,2008,359:378.

    [3] Escudier B,Eisen T,Stadler WM,et al.Sorafenib for treatment of renal cell carcinoma:Final efficacy and safety results of the phase III treatment approaches in renal cancer global evaluation trial〔J〕.J Clin Oncol,2009,27(20):3312.

    [4] Blumenschein GR Jr,Gatzemeier U,Fossella F,et al.Phase II,multicenter,uncontrolled trial of single-agent sorafenib in patients with relapsed or refractory,advanced non-small-cell lung cancer〔J〕.J Clin Oncol,2009,27(26):4274.

    [5] Huber S,Oelsner M,Decker T,et al.Sorafenib induces cell death in chronic lymphocytic leukemia by translational downregulation of Mcl-1〔J〕.Leukemia,2011,25(5):838.

    [6] Ramakrishnan V,Timm M,Haug JL,et al.Sorafenib,a dual Raf kinase/vascular endothelial growth factor receptor inhibitor has significant anti-myeloma activity and synergizes with common anti-myeloma drugs〔J〕.Oncogene,2010,29(8):1190.

    [7] Augustine CK,Toshimitsu H,Jung SH,et al.Sorafenib,a multikinase inhibitor,enhances the response of melanoma to regional chemotherapy〔J〕.Molecular Cancer Therapeutics,2010,9(7):2090.

    [8] Noriomi Matsumura,Masaki Mandai,Takako Okamoto,et al.Sorafenib efficacy in ovarian clear cell carcinoma rerealed by transcriptome profiling〔J〕.Cancer Sci,2010,101(12):2658.

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