UPLC-MS-MS法快速測定玉米中的黃曲霉毒素B1

于成廣

（濟(jì)南市農(nóng)業(yè)質(zhì)量檢測中心，濟(jì)南 250002）

黃輝

（中國兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，濟(jì)南 250031）

UPLC-MS-MS法快速測定玉米中的黃曲霉毒素B1

于成廣

（濟(jì)南市農(nóng)業(yè)質(zhì)量檢測中心，濟(jì)南 250002）

黃輝

（中國兵器工業(yè)集團(tuán)第五三研究所，濟(jì)南 250031）

采用高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法檢測玉米中的黃曲霉毒素B1。對樣品前處理?xiàng)l件、凈化和分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，黃曲霉毒素B1檢出限為0.02 μg／kg，回收率為83.8%～95.7%。建立的方法簡便、快速、靈敏度高，能夠滿足玉米中痕量黃曲霉毒素B1農(nóng)殘的高靈敏測定要求。

黃曲霉毒素B1；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；玉米

黃曲霉毒素B1(AFB1)是一種高毒性與高致癌性的物質(zhì)，毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氰化物、砷化物和有機(jī)農(nóng)藥，在所有的已知真菌毒素中， 黃曲霉毒素B1的毒性、致癌性是最強(qiáng)的， 也是所有真菌毒素中最穩(wěn)定的一種［1］。研究一種具有高靈敏度、高選擇性的測定黃曲霉毒素的方法，對于食品的安全性檢測和食品的質(zhì)量控制具有重要的意義。

目前應(yīng)用比較廣泛的黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法(TLC)［2］、高效液相色譜法(HPLC)［3，4］、酶聯(lián)免疫吸附測定法 ( ELISA)［5,6］等。薄層色譜法操作繁瑣、污染大、定量差、耗時長；而酶聯(lián)免疫法雖然操作簡單、靈敏度高，但特異性差；普通的HPLC結(jié)合熒光檢測的方法，黃曲霉毒素需要經(jīng)過衍生化以后才能進(jìn)行測定，操作繁瑣，分析時間長，消耗的溶劑量比較大［7,8］。筆者選用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法，在選擇反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式下對黃曲霉毒素B1進(jìn)行定性、定量分析，方法簡便、快速，具有較高的靈敏度和選擇性［9］，能夠?qū)Υ笈繕悠愤M(jìn)行快速分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜–三重四極桿質(zhì)譜儀：UPLC／Quattro premier型，美國Waters公司；

電子天平：BSA623S型，北京賽多利斯公司；

氮吹儀：N-EVAP型，美國 Organomation公司；

漩渦振蕩器：QL-866型，海門麒麟醫(yī)用儀器廠；

超聲波儀：SK5200LHC型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；

固相萃取柱：HLB型，容量為3 mL／60 mg，美國Waters公司；

乙腈、甲酸：色譜純，美國TEDIA 公司；

正己烷、氯化鈉：分析純，上海國藥試劑有限公司；

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品：美國Sigma公司；

實(shí)驗(yàn)用水：取自Millipore純水系統(tǒng)，電阻率不小于18.2 MΩ·cm。

1.2 色譜條件

色譜柱： C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相：乙腈–0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（70∶30）；流速：0.2 mL／min ；進(jìn)樣體積：5 μL ；柱溫：35℃。

1.3 質(zhì)譜條件

三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；離子源：正離子分析模式；毛細(xì)管電壓：3.2 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流速：450 L／h；碰撞池壓力：0.32 Pa；錐孔反吹氣流量：50 L／h。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

（1）黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用乙腈將黃曲霉毒素B1配制成100 mg／mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液， 4℃避光保存。用乙腈–水溶液（體積比50∶50）稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別配制成0.2，0.5，2，5，10，20，50，60 μg／mL 黃曲霉毒素 B1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

（2）樣品的提取

將玉米樣品粉碎后過830 μm（20目）篩，稱取5 g置于100 mL離心管中，加入50 mL乙腈–水溶液（體積比75∶25）、5 g氯化鈉及20 mL正己烷，搖勻，放入離心機(jī)中離心提取30 min。固相萃取柱預(yù)先用4 mL甲醇活化，準(zhǔn)確吸取上層清液10 mL過固相萃取柱，然后用4 mL甲醇分兩次洗脫混合柱,合并洗脫液于10 mL離心管中，然后用氮?dú)庥?0℃下吹干。用2 mL流動相溶解，渦旋30 s， 用0.22 μm微孔濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

分別使用丙酮、正己烷、乙腈萃取溶劑提取樣品，發(fā)現(xiàn)乙腈的回收率較高。為了獲得盡可能高的回收率，使用乙腈和水混合溶劑。當(dāng)溶劑中乙腈與水的體積比在70∶30～90∶10之間時，溶劑萃取效率最高，黃曲霉毒素的回收率也均達(dá)到較高水平，所以最終選取75∶25乙腈–水作為實(shí)驗(yàn)預(yù)處理的萃取溶劑。另外，樣品在乙腈水溶液中極易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，影響提取效率，在提取液中加入氯化鈉能起到明顯的破乳作用，同時可以增強(qiáng)離子化效應(yīng)，使乙腈與水分層，同時也使目標(biāo)物更完全地溶于乙腈中，起到較好的分離效果。此外，玉米成分復(fù)雜，含有色素和淀粉等基質(zhì)，如果凈化結(jié)果不理想，易產(chǎn)生干擾，污染色譜柱，將嚴(yán)重影響分離效果及檢測靈敏度，使回收率降低。為了解決這個問題，必須得到更好的凈化效果。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HLB固相萃取柱去除雜質(zhì)和色素的能力較好，有較高的回收率。

2.2 流動相的選擇

黃曲霉毒素B1易溶于甲醇和乙腈， 選擇乙腈–水作流動相時， 色譜系統(tǒng)分離效果比甲醇–水好，可以獲得較高的分辨率和靈敏度。將流動相中的水用0.1%的甲酸水溶液替代后得到的峰形更尖銳，靈敏度更高。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)乙腈和0.1%的甲酸水溶液的配比在70∶30時可獲得最高的靈敏度。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

在選定的色譜條件下，采用ESI+電離方式對黃曲霉毒素B1進(jìn)行檢測。首先，在ESI+電離方式下對黃曲霉毒素B1進(jìn)行全離子掃描，獲得母離子為m／z313.1，然后確定其二級離子，其中豐度最高、分子質(zhì)量較大的碎片離子m／z分別為241.0，269.0，285.1。以這3組碎片離子作為測定的特征目標(biāo)監(jiān)測離子，針對樣品進(jìn)行測定。結(jié)果表明，該組特征目標(biāo)離子測定靈敏度高，選擇性好，本底干擾物少，定量準(zhǔn)確。

表1 黃曲霉毒素B1質(zhì)譜參數(shù)

2.4 線性關(guān)系、回收率、精密度和檢出限

選擇穩(wěn)定性較好、豐度大的離子(m／z分別為 313.0，241.0，269.0和 285.1)作為監(jiān)測離子，使用MRM掃描方式。方法的回歸方程為y= 57.584x+6.412 1，線性范圍為0.2～60 μg／kg, 相關(guān)系數(shù)為0.997 5,檢出限為0.02 μg／kg ,定量限為0.1 μg／kg。取玉米樣品為空白,添加黃曲霉毒素B1后, 得到的UPLC–MS–MS結(jié)果如圖1和2，測定結(jié)果列于表2。

從圖2中看出，此方法黃曲霉毒素B1的響應(yīng)值較好，而在子離子中241.0的響應(yīng)值最好，適宜作為檢測黃曲霉毒素B1的定量離子。表2中的數(shù)據(jù)表明，該法3個標(biāo)準(zhǔn)添加水平的回收率為83.8%～95.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%～4.0%（n=6），精密度和準(zhǔn)確度可滿足農(nóng)殘分析需要。

表2 黃曲霉毒素B1的添加回收率和精密度

［1］楊惠芬，李明元，沈文.食品衛(wèi)生理化檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)手冊［M］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，1998: 271–287.

［2］Stroka J. Development of a simplified densitometer for the determination of aflatoxins by thin-layer chromatography［J］. J Chromatogr A，2000 , 904: 263–268.

［3］American Public Health Association etc. Standard Methods For the Water and Wastewater［S］. 14th Edition1, Washington DC: 1979:5 321.

［4］Edinboro L E，Karnes H T. Determination of aflatoxin B1 in sidestream cigarette smoke by immunoaffinity column extraction coupled with liquid chromatography／mass spectrometry［J］. J Chromatogr A，2005，1 083(1–2): 127–132.

［5］謝光洪, 于光, 肖成蕊，等. 黃曲霉毒素B1免疫檢測方法的新進(jìn)展［J］. 中國畜牧獸醫(yī) , 2007, 34(7): 145–146.

［6］Ardic M，Karakaya Y，Atasever M，et al.Determination of aflatoxin B1 levels in deep-red ground pepper (isot) using immunoaffinity column combined with ELISA［J］. Food Chem Toxicol， 2008,46 (5): 1 596–1 599.

［7］Madalina Tudorache， Camelia Bala. Sensitive Aflatoxin B1 Determination Using a Magnetic Particles-Based Enzyme-Linked Immunosorbent ［J］. Assay Sensors, 2008(8): 7 571–7 580.

［8］Ferracane R, Tafuri A, Logieco A, et al. Simultaneous determination of aflatoxin B1 and ochratoxin A and their natural occurrence in Mediterranean virgin olive oil［J］. Food additives and contaminants, 2007，24 (2): 173–180.

［9］楊靜,哈益明,王鋒. 高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法檢測花生中的黃曲霉毒素 B1［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2009，28(6): 35–38.

Ultra-High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry for Rapid Determination of A flatoxin B1 in Corn

Yu Chengguang
(Test Centre for Agriculture quality of Jinan, Jinan 250002, China)

Huang Hui
(CNGC Institue 53，Jinan 250031, China)

An analytical method for the determination of aflatoxin B1 in corn by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was developed. Sample pretreatment methods and depuration conditions were optimized. The detection limit of aflatoxin B1 was 0. 02 μg／kg. The recoveries were 83.8% – 95.7%.The results indicated that the method developed is simple, rapid, sensitive, which is suit for the analysis of aflatoxin B1 pesticides in corn.

aflatoxin B1; HPLC-MS／MS; corn

O657.7

A

1008–6145(2012)02–081–03

10.3969／j.issn.1008–6145.2012.02.025

聯(lián)系人：于成廣； E-mail: yucg1983@yeah.net

2011–12–14