EPO對大鼠腦缺血-再灌注后炎癥損傷的保護(hù)作用

寧顯忠，趙德福

(遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,遼寧錦州 121000)

近年來，促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)的神經(jīng)保護(hù)作用得到越來越多的學(xué)者的認(rèn)可，但對EPO發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能的具體機(jī)制和途徑目前尚知之甚少。眾所周知，以白細(xì)胞侵入為主要標(biāo)志的炎癥反應(yīng)是造成腦缺血-再灌注損傷的特征性改變。其中炎癥細(xì)胞因子誘發(fā)的黏附分子表達(dá)上調(diào)和由后者介導(dǎo)的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因素[1]。黏附分子當(dāng)中比較重要的是細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecules1,ICAM-1)及血管細(xì)胞間黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule1,VCAM-1)的。腦缺血后多種炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1和VCAM-1，二者通過與白細(xì)胞上的相應(yīng)受體結(jié)合，導(dǎo)致白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附、游出，進(jìn)而浸潤到血管外腦實質(zhì)，造成腦損傷。本研究通過驗證EPO對誘發(fā)炎癥反應(yīng)的ICAM-1和VCAM-1是否發(fā)揮抑制作用為切入點，著重探討EPO對腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性SD大鼠216只，體質(zhì)量250～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院動物中心提供。

1.2藥品與試劑 注射用重組人EPO(批號A20101001)為成都地奧九泓制藥廠產(chǎn)品，ICAM-1、VCAM-1抗體(貨號分別為sc-1511和sc-8304)為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1分組與給藥 將實驗大鼠隨機(jī)分為以下3組：(1)EPO干預(yù)組72只，缺血2 h后EPO腹腔注射，參照文獻(xiàn)[2]選擇EPO的有效劑量為3 000 U/kg，用生理鹽水溶解，濃度為200 U/mL，給藥后分別于再灌注3、6、12、24、48和72 h后取海馬組織；(2)模型組72只，按模型標(biāo)準(zhǔn)制成大鼠腦缺血-再灌注模型，分別于缺血2 h后腹腔注射等量生理鹽水，于再灌注3、6、12、24、48和72 h后取海馬組織；(3)假手術(shù)組72只，只進(jìn)行手術(shù)操作，不進(jìn)行缺血-再灌注處理，于假手術(shù)2 h后腹腔注射等量生理鹽水，分別于上述各時間點斷頭取海馬組織。每個時間點為一個亞組，每亞組12只大鼠。

表1 各組大鼠不同時間點VCAM-1蛋白的表達(dá)量

△：P<0.05，△△：P<0.01，與假手術(shù)組比較；▲▲：P<0.01，與模型組比較。

表2 各組大鼠不同時間點ICAM-1蛋白的表達(dá)量

△△：P<0.01，與假手術(shù)組比較；▲：P<0.05，▲▲：P<0.01，與模型組比較。

1.3.2模型的制備 采用線栓法制作大鼠大腦中動脈阻塞模型。水合氯醛麻醉(3 mL/kg)大鼠，分離左側(cè)頸總動脈，結(jié)扎其近心端，然后在頸總動脈上剪一個小口(約為動脈直徑的1/2)，將充滿肝素的動脈插管插入小口，用手術(shù)線結(jié)扎固定插管后，將長6 cm的漁線插入動脈插管直至大腦中動脈，腦缺血開始后將動脈插管拔出，把漁線和頸總動脈結(jié)扎在一起；2 h后拔出魚線，缺血-再灌注開始，以大鼠出現(xiàn)左側(cè)霍納氏征、右前肢伸展受限、活動時向右側(cè)旋轉(zhuǎn)為缺血-再灌注模型制備成功標(biāo)志。模型組和EPO干預(yù)組中的6個亞組分別再灌注3、6、12、24、48和72 h，假手術(shù)組6個亞組不進(jìn)行缺血-再灌注處理。

1.4標(biāo)本制取與檢測方法

1.4.1免疫組化法檢測海馬區(qū)ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá) 每個亞組取大鼠6只，烏拉坦麻醉(5 mL/kg)，灌流固定腦組織，斷頭取海馬組織，將標(biāo)本置于4%多聚甲醛液中固定，制成厚度為5 μm的病理切片。取上述切片常規(guī)脫蠟，蒸餾水洗滌，3%過氧化氫溶液處理30 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);分別滴加適當(dāng)稀釋的兔抗大鼠ICAM-1一抗或兔抗大鼠VCAM-1-抗，4 ℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);滴加辣根酶標(biāo)記羊抗兔多聚體(PV6001)，37 ℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次(每次5 min);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察海馬組織中ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá)情況。二者均主要于內(nèi)皮細(xì)胞膜表面表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀。

1.4.2Western blot分析海馬組織ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(dá) 取每組剩余6只大鼠，麻醉方法同上，取其海馬組織迅速置于―80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆?。Western blot 檢測分為以下6步：(1)制備蛋白樣品；(2)測定上清液蛋白含量；(3) 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳；(4)采用正電荷尼龍膜(PVDF)轉(zhuǎn)移；(5)雜交；(6)顯色分析，用Gene Genius凝膠圖像系統(tǒng)分析各蛋白目的條帶吸光度，用目的條帶與β-actin條帶吸光度的比值表示目的蛋白的含量。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化染色結(jié)果 觀察區(qū)域主要選擇在大鼠海馬組織的CA1區(qū)，黏附分子的表達(dá)部位主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。結(jié)果顯示，假手術(shù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞表面有極少量VCAM-1和ICAM-1蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞；與假手術(shù)組比較，模型組ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的陽性細(xì)胞于再灌注6 h開始逐漸增多，再灌注后12～48 h明顯增多，以后有所減少；與模型組各時間點相比較，EPO干預(yù)組VCAM-1的表達(dá)量從12 h開始減少，24～72 h明顯減少，而ICAM-1從6 h即開始減少，12～72 h明顯減少。

圖1 各組大鼠不同時間點VCAM-1蛋白的

圖2 各組大鼠不同時間點ICAM-1蛋白的

2.2Western blot檢測結(jié)果 假手術(shù)組有極少量VCAM-1和ICAM-1蛋白的表達(dá)。與假手術(shù)組比較，模型組再灌注6 h VCAM-1和ICAM-1蛋白可見有少量表達(dá)，以后表達(dá)量逐漸增多，VCAM-1的表達(dá)高峰出現(xiàn)在再灌注24～48 h；而ICAM-1則在再灌注12～48 h一直持續(xù)較高，以后表達(dá)量逐漸減少。與模型組各時間點相比較，EPO干預(yù)組VCAM-1的表達(dá)量從12 h開始減少，24～72 h明顯減少，而ICAM-1從6 h即開始減少，12～72 h明顯減少。見表1、2，圖1、2。

3 討 論

近年來，對于EPO的神經(jīng)保護(hù)作用的關(guān)注越來越多。但關(guān)于EPO對腦缺血-再灌注后炎癥損傷的抑制作用，尤其是對于誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)黏附分子的抑制作用，國內(nèi)外鮮有報道。

本實驗通過線栓法制作成年大鼠局灶性腦缺血-再灌注模型，觀察VCAM-1和ICAM-1蛋白在腦缺血-再灌注損傷中的作用，以及EPO對此過程的抑制作用。研究結(jié)果顯示，在大鼠局灶性腦缺血-再灌注6 h，即有VCAM-1和ICAM-1蛋白的少量表達(dá)，不論是陽性細(xì)胞數(shù)還是表達(dá)量都較假手術(shù)組有所增加，之后表達(dá)量逐漸增多，VCAM-1的表達(dá)高峰出現(xiàn)在再灌注24～48 h，而ICAM-1的表達(dá)則在再灌注12～48 h一直持續(xù)較高，以后表達(dá)量有所減少。需要指出的是，內(nèi)皮細(xì)胞無論在未被激活還是被激活后表達(dá)的ICAM-1均高于VCAM-1，并且ICAM-1在腦損傷后的上調(diào)表達(dá)要早于VCAM-1，而其下降又稍晚于VCAM-1?？梢奍CAM-1相對于VCAM-1容易表達(dá)且較穩(wěn)定，也說明前者在腦損傷發(fā)生中起主要作用。

EPO是由腎臟和胚胎肝臟產(chǎn)生的一種能促進(jìn)紅細(xì)胞生成的細(xì)胞因子，主要用于治療多種原因所致的貧血。但近年的研究發(fā)現(xiàn)，在許多非造血細(xì)胞系如腎、心肌、平滑肌和神經(jīng)原細(xì)胞中也存在EPO及其受體(erythropoietin receptor,EPOR)基因表達(dá)[3]。動物實驗和體外細(xì)胞培養(yǎng)已證實，EPO對腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用[4]。本實驗于大鼠缺血后2 h給予EPO腹腔注射，研究結(jié)果顯示，與模型組相比較，應(yīng)用EPO后，EPO干預(yù)組VCAM-1和ICAM-1蛋白的陽性細(xì)胞數(shù)和蛋白表達(dá)量均有所下降。而且需要指出的是，ICAM-1于用藥后6 h即開始下降，而 VCAM-1于用藥后12 h才開始下降，表明在誘導(dǎo)炎癥作用時作用相對較大的ICAM-1對EPO的反應(yīng)也相對較VCAM-1敏感。由此可見，EPO可以通過抑制ICAM-1和VCAM-1蛋白表達(dá)的上調(diào)(主要是ICAM-1)，實現(xiàn)對腦缺血-再灌注損傷后炎癥損傷的抑制作用。

近幾年來，關(guān)于EPO的神經(jīng)保護(hù)作用研究方興未艾，其機(jī)制除了抗炎作用以外，目前正在研究中的還有抗谷氨酸興奮毒性[5]、調(diào)節(jié)一氧化氮(NO)的合成[6]、抗氧化作用、抗神經(jīng)元凋亡[7-8]、促進(jìn)血管生成[9]、促進(jìn)神經(jīng)元再生和神經(jīng)營養(yǎng)作用等。其對腦血管的保護(hù)作用正逐漸成為臨床和科研的新熱點[10]。尤其是近來的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血動物腦內(nèi)可見EPO和EPOR表達(dá)[11]，外源性EPO可通過血腦屏障進(jìn)入腦內(nèi)[12]，為EPO的臨床應(yīng)用墊定了理論基礎(chǔ)。因此，EPO在腦缺血-再灌注損傷的應(yīng)用方面有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

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