高效液相色譜法測定麝香風濕片中烏頭堿的含量

李明梅

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術學院，江蘇 鹽城 224005)

高效液相色譜法測定麝香風濕片中烏頭堿的含量

李明梅

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術學院，江蘇 鹽城 224005)

目的 建立麝香風濕片中烏頭堿含量的高效液相色譜測定方法。方法 采用Agilent C18柱(4．6 mm×150 mm，5 μm);流動相:甲醇-0．05%磷酸溶液(含 0．04%三乙胺)(68∶32);流速 0．8 mL/min;檢測波長:235 nm;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。結果 烏頭堿在0．200 6～20．06 μg/mL濃度范圍與峰面積呈良好線性關系，r=0．999 9，最低檢測限約為2 ng，平均回收率為97．7%。結論 此方法具有快速、簡便、靈敏、準確等特點，適合于麝香風濕片中烏頭堿的含量測定。

麝香風濕片;烏頭堿;含量測定;高效液相色譜法

麝香風濕片主要由制川烏、全蝎、烏梢蛇、地龍、蜂房、麝香、黑豆等組成，用于風濕寒痹，關節(jié)疼痛，手足拘攣等［1］。其中川烏所含的烏頭堿具有很強毒性［2］。

根據(jù)國家藥典委員會國家藥品標準(中藥)提高工作技術要求(2006．8．29)的規(guī)定，制劑中如果含有有毒成分，尤其是有效劑量與中毒劑量相對接近的成分，應規(guī)定含量上下限。關于烏頭堿限量及含量測定的問題，如果處方用到的是生川烏、生草烏，必須按要求做限量檢查或含量測定，并規(guī)定上下限。如果用到的是制川烏、制草烏，附子、附片，外用藥可不做限量檢查。藥材中酯型生物堿的限量檢查的方法不適用于成藥，可建立 HPLC方法測定烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿，并制訂合理的上下限。

根據(jù)現(xiàn)行的麝香風濕片標準，在其檢查項中只列了烏頭堿的限量檢查(薄層色譜法)［1］，并且該限量檢查的上限與2010版藥典有關制川烏中烏頭堿限量的規(guī)定存在較大的差距。為此，本研究建立了測定麝香風濕片中烏頭堿含量的高效液相色譜(HPLC)法，以便替代限量檢查，對藥品質量進行更有效地控制。

1 儀器與試藥

G1311A四元高效泵液相測定儀;G1314B紫外檢測器;Agilent1200色譜工作站;CS-9301PC薄層掃描儀;Waters2695高效液相色譜儀。

烏頭堿對照品(批號:110720-200410)，中國藥品生物制品檢定所;麝香風濕片(批號:090102，090325，090428，081217，091120，091207)，汕頭市萊達制藥有限公司;甲醇、磷酸、三乙胺均為色譜純;其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2．1 溶液配制

2．1．1 對照品儲備液 取烏頭堿對照品約10 mg，精密稱定，置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。配制的烏頭堿儲備液濃度為2．006 mg/mL。

2．1．2 麝香風濕片供試品溶液 取麝香風濕片20片，除去包衣，精密稱定總量后，將片劑置于研缽中研成細粉，取約4 g，精密稱定，置錐形瓶中，加氨試液2 mL潤濕，再精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液50 mL，稱定重量，超聲30 min。放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干。殘渣加甲醇溶解并定量稀釋至5 mL，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2．1．3 陰性樣品溶液 按麝香風濕片處方［1］，制成缺制川烏的模擬制劑，按2．1．2項下方法制備陰性樣品溶液。

2．2 色譜條件

色譜柱:Agilent C18色譜柱(4．6 mm ×150 mm，5 μm);流動相:甲醇-0．05%磷酸溶液(含 0．04% 三乙胺)(68∶32);流速:0．8 mL/min;檢測波長:235 nm;柱溫:30℃;進樣量:10 μL。理論板數(shù)以烏頭堿峰計在3 000以上。

分別精密量取2．006 μg/mL烏頭堿對照品溶液、麝香風濕片供試品溶液和陰性樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。陰性樣品溶液色譜圖中，在烏頭堿對照品峰相應位置無色譜峰，供試品溶液烏頭堿色譜峰與其相鄰峰能達到基線分離。其它成分對烏頭堿含量測定無干擾。

圖1 烏頭堿對照品溶液(A)、麝香風濕片供試品溶液(B)和陰性樣品溶液(C)HPLC圖

2．3 方法學考察

2．3．1 線性范圍考察 取烏頭堿對照品儲備液用甲醇稀釋成濃度為0．200 6 ～20．06 μg/mL 的系列對照品溶液，分別精密量取10 μL注入液相色譜儀，按2．2項下色譜條件進行試驗。以濃度(C，μg/mL)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線。進行線性回歸，得回歸方程:C=6．80×10－4A－2．36 × 10－4，r=0．999 9。結果表明烏頭堿在0．200 6 ～20．06 μg/mL 濃度范圍內與峰面積具有良好的線性關系。

2．3．2 精密度試驗 精密吸取2．006 μg/mL烏頭堿對照品溶液，連續(xù)進樣6次，并同時在兩臺液相色譜儀上測定，測得峰面積RSD(n=6)分別為0．7%和0．6%。結果表明該方法具有良好的精密度和重復性。

2．3．3 檢測限考察 取2．006 μg/mL烏頭堿對照品溶液逐級稀釋，在信噪比為3時，烏頭堿檢測限為2 ng。

2．3．4 溶液穩(wěn)定性 試驗時發(fā)現(xiàn)，烏頭堿對照品溶液室溫放置不很穩(wěn)定，需在冰箱保存。取麝香風濕片供試品溶液(冰箱保存)，分別在 0，2，4，6 h測定峰面積，RSD為0．31%，可見，冰箱保存時，供試品溶液至少在6 h內穩(wěn)定。

2．3．5 加樣回收率試驗 取已知含量的麝香風濕片(批號090325)細粉適量，精密稱定，加烏頭堿對照品液，照含量測定方法操作，計算回收率，結果見表1。平均回收率為97．7%，RSD為0．54%

表1 烏頭堿加樣回收率的試驗結果

2．4 樣品含量測定

取麝香風濕片，按2．1．2項下方法制備供試品溶液，按2．2 項下色譜條件進行測定，取 2．006 μg/mL烏頭堿對照品溶液，同法測定，按外標法以峰面積計算即得。6批麝香風濕片(批號:090102，090325，090428，081217，091120，091207)中的烏頭堿的含量分別為 2．18，2．20，2．19，2．31，2．23，2．36 μg/片，平均含量為 2．24 μg/片，RSD 為 3．27%。

3 討論

3．1 溶劑的選擇

［3-5］，曾選擇甲醇、乙醇和二氯甲烷等溶劑進行試驗，結果表明烏頭類生物堿在乙醇中拖尾現(xiàn)象嚴重，對稱系數(shù)達不到理想值;在二氯甲烷中比較穩(wěn)定，但在紫外檢測時存在極接近的干擾峰，影響目標成分的響應;在甲醇中不穩(wěn)定，但不影響烏頭類生物堿的紫外吸收。故本次實驗選用甲醇為溶劑，因烏頭堿在甲醇溶液中不很穩(wěn)定，故樣品的甲醇溶液不能久置，需盡快測定，其在0℃冰箱中保存較穩(wěn)定。

3．2 流動相的選擇

烏頭堿分子極性較強，比較適合用高效液相色譜分析，常用的流動相有甲醇-水-氯仿-三乙胺系統(tǒng)、甲醇-水-氯仿-二乙胺系統(tǒng)和甲醇-水-乙睛系統(tǒng)等。由于本品成分復雜，經(jīng)文獻查找，0．04%三乙胺可以滿足烏頭堿與雜質峰的分離，且得到較好的峰形［6］，并在流動相中加入少量酸，可使分離達到目的，并使流動相的 pH值在色譜柱的適合范圍內［7］。故選擇了甲醇-0．05%磷酸溶液(含0．04%三乙胺)(68∶32)作為流動相，得到了較好的分離效果。

3．3 測定波長的選擇

文獻報道烏頭類生物堿在230～240 nm下有較大吸收［8］，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)在235 nm測定效果最佳，基線也較穩(wěn)定，因此選擇該波長進行檢測。

3．4 提取條件的選擇

樣品的處理:烏頭類生物堿的提取采用2010版中國藥典所用的方法，氨水潤濕后用異丙醇-乙酸乙酯(1∶1)提取。由于最后的溶劑選擇了甲醇，因此在最后步驟中采用了超聲使烏頭堿溶解，提高實驗的精確度。

本文建立了麝香風濕片中烏頭堿的HPLC測定方法，測定了6批麝香風濕片中烏頭堿的含量，平均含量為2．24 μg/片，可為麝香風濕片中烏頭堿含量標準的制定提供參考。

參考文獻:

［1］ WS-10187(ZD-0187)-2002，麝香風濕片標準［S］//中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準，中藥成方制劑第三冊．

［2］ 王文采．中國植物志［M］．27卷．北京:科學出版社，1979:26-319．

［3］ 李婭萍，田頌九，王國榮．烏頭類藥物的化學及分析方法概況［J］．中國中醫(yī)雜志，2000，26(10):659-662．

［4］ 王兆基，何紹基，徐樹棋．液相色譜/質譜/質譜聯(lián)用法測定烏頭屬藥材及中成藥中烏頭類生物鹼含量［J］．分析化學，2001，29(4):391-395．

［5］ 李路娥，羅 群，王躍華，等．烏頭堿檢測方法綜述［J］．成都大學學報:自然科學版，2005，24(1):18-20．

［6］ 聶 晶，張立群，田頌九，等．高效液相色譜法分離測定康復新膠囊中烏頭類生物堿含量［J］．藥物分析雜志，2001，21(6):57-59．

［7］ 孫毅坤，趙惠萍，周富榮．HPLC測定肺康膏中次烏頭堿的含量［J］．中成藥，1999，21(12):626-629．

［8］ 黃建明．草烏中生物堿含量測定方法的研究［J］．中藥材，2002，25(12):878-879．

Research on the HPLC method for determining the content of aconitine in Shexiang Fengshi tablets

LI Ming-mei
(Yancheng Health Vocational Technical College，Yancheng 224005，China)

Purpose To develop a method for deteminating aconitine in Shexiang Fengshi tablets by HPLC．Methods The Agilent C18(4．6 mm ×150 mm，5 μm)was used．With a mobile phase of methanol-0．05%phosphoric acid solution(contained 0．04%triethylamine)(68∶32)，the flow rate was 0．8 mL/min，the detection wavelength was 235 nm，the column temperature was 30 ℃，and the injection was 10 μL．Results The linearity of peak area was good in the range of 0．200 6-20．06 μg/mL(r=0．999 9)．The average recovery was 97．7%．Conclusion This method is convenient and accurate．The results of experiment were satisfactory．

Shexiang Fengshi tablet;aconitine;determination;HPLC

R927．2

A

1005-1678(2012)06-0836-03

2012-07-12

李明梅，女，副教授，主要研究方向:化學分析，藥物分析。