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    芥子堿對Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠海馬神經(jīng)元再生的影響

    2012-11-17 08:31:14宋貴軍林璐璐曹云鵬
    中國生化藥物雜志 2012年6期
    關(guān)鍵詞:芥子海馬功能障礙

    宋貴軍,林璐璐,李 昱,曹云鵬

    (1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 大連 116027;2.中國醫(yī)科大學(xué) 附屬一院 神經(jīng)內(nèi)科,遼寧 沈陽 110001)

    阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,主要特征為進行性認(rèn)知功能障礙[1]。新生神經(jīng)元未能替代病變神經(jīng)元是影響AD預(yù)后的關(guān)鍵因素。海馬在AD患者病程發(fā)展中具有重要作用,而該部位的神經(jīng)元再生情況是治療AD患者的重要靶點[2-3]。芥子堿(sinapine,3.5-二甲基,4-羥基苯丙烯酰膽堿)是廣泛存在于十字花科植物中的酚類小分子生物堿,具有抗氧化、抗衰老、抗輻射等多種生物學(xué)功效[4]。研究表明,芥子堿可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶障礙,并可改善海馬膽堿功能缺失,提示芥子堿是可用于AD的治療[5]。但目前對芥子堿能否促進AD的海馬神經(jīng)元再生及改善相關(guān)指標(biāo)水平尚不清楚,因此本研究給予Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠芥子堿處理,觀察對海馬神經(jīng)元再生及相關(guān)指標(biāo)的影響,為AD的治療提供依據(jù)。

    1 材料

    芥子堿(純度>93%),上海酶聯(lián)生物科技有限公司;Aβ25-35、二甲亞砜(DMSO)、TritonX100,美國Sigma公司;β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記鼠二抗、兔二抗單克隆抗體,美國Santa Cruz公司;海馬生長相關(guān)蛋白43(GAP-43)和突觸素(P38)多克隆抗體,美國Cell Sigaling Technology公司;BCA蛋白分析試劑盒,碧云天生物科技公司;TUNEL顯色試劑盒,Roche公司;丙二醛(MDA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和超氧化物歧化酶(SOD)活性試劑盒,南京建成生物工程研究所。

    健康雄性ICR小鼠,體重25~30 g,購于北京維通利華公司,合格證號:SCXK(京)2011-0034。

    2 方法

    2.1 Aβ25-35小鼠模型制備

    采用側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ25-35誘導(dǎo)認(rèn)知功能障礙小鼠模型:將Aβ25-35肽段溶于水中,終濃度為3 mmol/L,封口膜封口后于37℃水浴中孵育96 h。腹腔注射2%水合氯醛溶液(10~20mL/kg)麻醉小鼠,將其固定于腦立體定位儀上。行顱頂正中切開,暴露顱骨,以前囟點為坐標(biāo),前囟點后0.3 mm,右側(cè)1 mm,深2.5 mm為側(cè)腦室注射坐標(biāo),緩慢注射Aβ25-35溶液5 nmol(1.7μL),留針3 min,保證溶液充分進入側(cè)腦室。而假手術(shù)組則注射生理鹽水1.7μL,其余操作步驟與Aβ25-35組一致。術(shù)畢縫合皮膚。

    2.2 分組及給藥

    將小鼠分為4組:假手術(shù)組、Aβ25-35組、假手術(shù)+芥子堿組和Aβ25-35+芥子堿組,每組各10只。Aβ25-35組和Aβ25-35+芥子堿組為采用側(cè)腦室內(nèi)注射Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠,其余兩組為正常小鼠;假手術(shù)+芥子堿組和Aβ25-35+芥子堿組于術(shù)后灌胃給予芥子堿30mg/kg,1次/d,連續(xù)3周,其余兩組給予等體積的水。

    2.3 學(xué)習(xí)記憶功能檢測

    采用Y型電迷宮法檢測學(xué)習(xí)和記憶功能。小鼠在電壓(70 mV)電擊足部,向三等分輻射式反射箱逃避,反射箱的三個手臂頂端均有信號燈,且燈亮?xí)r則示意此臂安全無電。造模后1周將小鼠放入Y型電迷宮內(nèi)讓其適應(yīng)環(huán)境,當(dāng)小鼠由電擊區(qū)域逃至不通電區(qū)域時為正確反應(yīng)。記錄每組的學(xué)習(xí)成績(連續(xù)10次中有9次正確反應(yīng)所需要的電擊次數(shù))和記憶成績(連續(xù)10次測試中的正確反應(yīng)次數(shù))。

    2.4 細胞凋亡指數(shù)

    過量麻醉法處死小鼠,迅速斷頭取腦,采用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈,置于液氮中至適當(dāng)硬度;取出固定后的鼠腦,選擇海馬CA1區(qū),用冰凍切片機進行冠狀連續(xù)切片,腦片厚度為40μm,每隔200μm取1張,每只小鼠取12張腦片。采用TUNEL試劑盒進行腦片染色,采用顯微鏡觀察形態(tài),于每組隨機選取5個高倍鏡視野,分別計數(shù)凋亡細胞數(shù)和總細胞數(shù),并計算凋亡指數(shù)。

    2.5 ELISA法檢測海馬 MDA、TNF-α 水平和SOD活性

    取海馬組織,于冰上研磨并裂解15 min;12 000 r/min離心20 min,收集上清,并分別采用MDA、TNF-α和SOD試劑盒來檢測相應(yīng)指標(biāo),操作步驟依據(jù)試劑盒說明書。

    2.6 Western blot實驗

    取海馬組織,加入全蛋白提取緩沖液0.5mL于冰上裂解15 min;12 000 r/min離心20 min后,取上清并采用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與加樣緩沖液混合,取等量蛋白加樣并行10%SDSPAGE凝膠電泳。電泳條件:濃縮膠恒壓80 V約20 min,分離膠100 V約80 min。半干轉(zhuǎn)至PVDF膜,按約0.1mL/cm2的量加適量一抗,GAP-43和P38Akt的稀釋比例為分別為1∶200和1∶400。4℃孵育過夜。TBST漂洗PVDF膜,加入二抗(稀釋比例1∶3 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h,然后用TBST充分洗膜。采用ECL法來顯色處理,膠片曝光后觀察蛋白的條帶,并采用Gel-Pro analyzer分析各顯影條帶的光密度,蛋白相對表達量為與β-actin的比值。

    2.7 統(tǒng)計學(xué)處理

    3 結(jié)果

    3.1 芥子堿對Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

    Aβ25-35組的學(xué)習(xí)次數(shù)多于假手術(shù)組,記憶次數(shù)少于假手術(shù)組(P<0.05),而芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導(dǎo)引起的學(xué)習(xí)次數(shù)增多和記憶次數(shù)減少(P<0.05),但仍與假手術(shù)組有差異(P<0.05);芥子堿處理對假手術(shù)組的學(xué)習(xí)記憶功能無影響,見表1。

    表1 4組小鼠的學(xué)習(xí)和記憶情況

    3.2 芥子堿對Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

    Aβ25-35組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率為(39.48±5.78)%,高于假手術(shù)組的(0.95±0.32)%(P<0.05);而Aβ25-35+ 芥子堿組為(22.83±6.57)%,可見,芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導(dǎo)引起的CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率升高,但仍與假手術(shù)組有差異(P<0.05);假手術(shù) + 芥子堿組為(0.87±0.41)%,可見,芥子堿處理對假手術(shù)組的CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡率無影響。TUNEL染色圖見圖1。

    圖1 芥子堿對對海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響

    3.3 芥子堿對Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠海馬MDA、SOD和TNF-α的影響

    Aβ25-35組的MDA和TNF-α水平高于假手術(shù)組,SOD活性低于假手術(shù)組(P<0.05),而芥子堿處理可改善 Aβ25-35誘導(dǎo)引起的MDA和TNF-α水平升高,SOD活性降低,但仍與假手術(shù)組有差異(P<0.05);芥子堿處理對假手術(shù)組的海馬MDA、SOD和TNF-α水平無影響,見表2。

    3.4 芥子堿對Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠海馬GAP-43和P38的影響

    Aβ25-35組的GAP-43和P38蛋白水平均低于假手術(shù)組(P<0.05),而芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導(dǎo)引起的GAP-43和P38蛋白水平降低,但仍與假手術(shù)組有差異(P<0.05);芥子堿處理對假手術(shù)組的海馬GAP-43和P38蛋白水平無影響,見表3。Western blot結(jié)果見圖2。

    表2 4組小鼠海馬的MDA、SOD和TNF-α水平比較

    表3 4組小鼠海馬的GAP-43和P38水平比較(相對光密度)

    圖2 芥子堿對海馬GAP-43和P38蛋白的影響

    4 討論

    芥子堿是廣泛存在于十字花科植物中的一種酚類小分子生物堿,具有多種生物功能,如抗氧化、抗輻射、抗炎、抗衰老等[4]。近期研究表明,芥子堿可改善癡呆大鼠的乙酰膽堿功能缺失,并改善學(xué)習(xí)功能障礙[5],提示其在治療AD中具有較好的應(yīng)用前景。

    本研究結(jié)果表明,Aβ25-35處理可導(dǎo)致小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能障礙,主要與側(cè)腦室注射Aβ25-35可引起神經(jīng)系統(tǒng)退化有關(guān),如突觸丟失、神經(jīng)元變性、學(xué)習(xí)記憶能力受損[6]。而芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導(dǎo)引起的學(xué)習(xí)記憶障礙,但仍與假手術(shù)組有差異,表明芥子堿可改善Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠的學(xué)習(xí)和記憶損傷。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)Aβ25-35處理的海馬神經(jīng)元凋亡增多,表明Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠的神經(jīng)再生受到抑制,也是Aβ25-35處理的小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)和記憶功能障礙的主要原因。芥子堿可降低Aβ25-35誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細胞凋亡率增加,提示其對改善Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠海馬區(qū)神經(jīng)再生有一定的促進作用。

    氧化應(yīng)激導(dǎo)致的自由基損傷可影響AD的治療效果,而MDA、TNF-α水平和SOD活性是評價氧化應(yīng)激的常用指標(biāo)。GAP-43是神經(jīng)元生長發(fā)育和神經(jīng)可塑性的首選分子探針[7],P38是評價海馬神經(jīng)元突觸發(fā)育過程中的常用指標(biāo)[8]。因此,采用以上指標(biāo)來評價芥子堿處理對海馬分子指標(biāo)的影響,發(fā)現(xiàn)芥子堿處理可改善Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠海馬區(qū)以上指標(biāo)的異常,表明其可改善海馬氧化應(yīng)激水平,并促進神經(jīng)的再生。以上指標(biāo)的變化提示降低氧化應(yīng)激水平、促進突觸發(fā)育和神經(jīng)可塑是芥子堿發(fā)揮認(rèn)知障礙保護作用的可能機制。

    綜上所述,芥子堿可改善Aβ25-35誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能障礙,降低海馬神經(jīng)元凋亡,并緩解海馬區(qū)與神經(jīng)再生相關(guān)蛋白及分子的水平。

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