大黃素對(duì)糖尿病大鼠腎組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)的影響

何勁松，曹東維

(南京大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 附屬鼓樓醫(yī)院 腎臟科，江蘇 南京，210008)

大黃素對(duì)糖尿病大鼠腎組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)的影響

何勁松，曹東維

(南京大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 附屬鼓樓醫(yī)院 腎臟科，江蘇 南京，210008)

目的 探討大黃素對(duì)糖尿病大鼠腎組織單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達(dá)的影響。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病對(duì)照組、糖尿病大黃素治療組，經(jīng)大黃素治療糖尿病大鼠2，4和8周后，分別觀察大鼠血肌酐及24 h尿蛋白定量，以及腎臟MCP-1表達(dá)的變化。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠的24 h尿蛋白以及腎組織MCP-1表達(dá)顯著增加，經(jīng)大黃素治療后上述指標(biāo)在一定程度上有所減輕。結(jié)論 糖尿病時(shí)MCP-1表達(dá)增加，大黃素可能通過抑制糖尿病大鼠腎臟MCP-1表達(dá)而達(dá)到延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。

大黃素;糖尿病;單核細(xì)胞趨化蛋白-1;腎組織

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其確切的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是特異性的單核巨噬細(xì)胞趨化因子，MCP-1在腎臟中主要分布于腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞，其作用主要是募集并激活單核-巨噬細(xì)胞在腎組織浸潤。在DN腎組織中發(fā)現(xiàn)有較多該介質(zhì)表達(dá)，提示其可能參與DN的發(fā)展有關(guān)。MCP-1可促進(jìn)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的腎損害，巨噬細(xì)胞在糖尿病小鼠腎臟的積聚與局部MCP-1上調(diào)有關(guān)，MCP-1介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞積聚和活化在對(duì)STZ誘導(dǎo)的DN小鼠的腎損害進(jìn)展中起關(guān)鍵作用［1］。本實(shí)驗(yàn)研究大黃素對(duì)糖尿病大鼠腎組織MCP-1表達(dá)的影響，從而揭示大黃素預(yù)防和治療DN的機(jī)制。

1 材料

大黃素粉(99．9%)，購自江蘇省淮陰市醫(yī)藥公司;STZ，購自美國Sigma公司;兔抗鼠MCP-1抗體購自美國Biovision公司;RT-PCR試劑購于invitrogen、Promega等公司。MCP-1引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，序列:正義鏈(5'→3'):TATGCAGGTCTCTGTCACGC;反義鏈(5'→3'):AAGTGTTGAACCAGGATTCACAGAPDH(內(nèi)參)引物序列上海生工生物工程技術(shù)公司合成，序列:正義鏈(5'→3'):TCCCTCAAGATTGTCAGCAA;反義鏈(5'→3'):AGATCCACAACGGATACATT。

雄性SD大鼠72只，8～10周齡，體質(zhì)量160～220 g，由南京青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(蘇)2001-0018。

2 方 法［2］

2．1 動(dòng)物分組和處置［2］

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3大組，即正常對(duì)照組(N組)、糖尿病對(duì)照組(D組)和糖尿病大黃素治療組(E組)，其中各組按其治療2，4和8周再分為3小組，每小組8只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各小組大鼠數(shù)目不少于6只。糖尿病藥物治療組均預(yù)給藥2 d，隨后連續(xù)給藥8周。大黃素100 mg/kg灌胃，正常對(duì)照組及糖尿病對(duì)照組給予0．5%羧甲基纖維素鈉10 mL/kg灌胃，用藥第7天同時(shí)單次尾靜脈注射2%STZ溶液60 mg/kg，正常對(duì)照組僅給予等量檸檬酸緩沖液。于實(shí)驗(yàn)第2，4和8周末處死大鼠。處理前1天收集大鼠24 h尿，測尿蛋白。從大鼠腹主動(dòng)脈抽血5 mL，離心取血清測血肌酐等指標(biāo)，抽血后立刻用DEPC水配置的磷酸鹽溶液從腹主動(dòng)脈對(duì)腎臟進(jìn)行原位灌洗至腎臟發(fā)白。取出腎臟去除包膜切取皮質(zhì)。部分立即放入－80℃冰箱中保存供逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測定MCP-1 mRNA，部分組織于多聚甲醛中固定做免疫組化分析。

2．2 檢測方法

用羅氏血糖儀測定尾靜脈血糖，使用生化儀檢測大鼠尿蛋白和血肌酐等。使用免疫組織化學(xué)SP法檢測腎小球中MCP-1蛋白水平的表達(dá)，RT-PCR檢測MCP-1 mRNA表達(dá)，按照Trizol試劑盒說明書提取腎皮質(zhì)的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA，多循環(huán)PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。

2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS12．0軟件，數(shù)據(jù)以(x±s)表示，多組之間的比較用單因素方差分析方法，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 血肌酐及24 h尿蛋白定量結(jié)果

大鼠糖尿病模型制備成功，數(shù)據(jù)已在前文發(fā)表［2］。各組大鼠的血肌酐無明顯差異，2周開始糖尿病大鼠的24 h尿蛋白定量出現(xiàn)升高，經(jīng)過治療，E組大鼠第8周出現(xiàn)尿蛋白定量低于同周D組，見表1。

3．2 各組大鼠MCP-1免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果

結(jié)果見表2。D組第2，4和8周腎組織MCP-1蛋白表達(dá)均高于同周N組，經(jīng)治療后E組從第4周起腎組織MCP-1蛋白表達(dá)均低于同周D組。

3．3 各組RT-PCR之間比較

結(jié)果見表2。第2周開始，D組和F組大鼠MCP-1mRNA表達(dá)開始上升，治療后第4和8周E組大鼠腎組織的MCP-1mRNA表達(dá)明顯低于同周D組。

表1 各組大鼠血肌酐、尿蛋白的變化(x±s)

表2 各組大鼠MCP-1免疫組織化學(xué)及RT-PCR結(jié)果

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠24 h尿蛋白明顯增加，且糖尿病大鼠腎組織MCP-1表達(dá)明顯升高，在應(yīng)用大黃素治療后，MCP-1表達(dá)明顯減少，糖尿病大鼠尿蛋白的排泄也明顯減少，提示大黃素可能通過抑制MCP-1的表達(dá)而減輕糖尿病大鼠的腎損害。

MCP-1能趨化和激活單核巨噬細(xì)胞。它可以誘導(dǎo)70%～80%的單核巨噬細(xì)胞趨化活動(dòng)。在腎臟病急性期，單核巨噬細(xì)胞釋放可溶性介質(zhì)參與新月體的形成，釋放氧自由基、蛋白酶，分泌細(xì)胞因子及生長因子等物質(zhì)，造成組織損傷。慢性期后，單核巨噬細(xì)胞通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子α等致纖維化的細(xì)胞因子促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，腎小球硬化，最終造成腎功能衰竭。在DN中單核巨噬細(xì)胞的浸潤可引起細(xì)胞外基質(zhì)堆積、基底膜增厚等，從而發(fā)展為腎小球硬化，導(dǎo)致臨床蛋白尿的出現(xiàn)和腎功能損害［3］。

已經(jīng)有大量研究證實(shí)大黃素對(duì)腎臟有較好的保護(hù)作用。如大黃素有抑制成纖維細(xì)胞增殖和促其凋亡的作用，從而達(dá)到減輕腎間質(zhì)纖維化病變［4］。用細(xì)胞培養(yǎng)的方法證實(shí)，大黃素是通過抑制DNA合酶及延緩細(xì)胞周期來抑制人腎纖維母細(xì)胞增殖，為臨床應(yīng)用大黃素提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)［5］。大黃素能明顯抑制腎臟代償性肥大，其作用與減少尿上皮細(xì)胞生長因子排泄量有關(guān)［6］。

從本研究結(jié)果來看，大黃素組腎臟MCP-1表達(dá)從第2周即與糖尿病組有差異，一直持續(xù)到第8周。既往研究表明單味大黃可以通過抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)，改善腎微循環(huán)，清除氧自由基，糾正脂質(zhì)代謝紊亂，抑制腎小球系膜細(xì)胞生長，抑制腎代償肥大和殘余腎的高代謝水平，改善氮質(zhì)代謝，從而達(dá)到延緩慢性腎臟病的進(jìn)展［7］。寧英遠(yuǎn)等［8］研究大黃素對(duì)人腎成纖維細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)大黃素抑制了人腎成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的進(jìn)程。提示大黃素通過抑制細(xì)胞DNA合成，延遲細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制了細(xì)胞增殖。

從本研究結(jié)果來看，至第8周大黃素組可以降低蛋白尿，且與糖尿病組有顯著性差異。提示大黃素可以延緩糖尿病大鼠腎臟損害的進(jìn)展。大黃素的對(duì)DN保護(hù)一定程度上來源于抑制大鼠腎臟MCP-1的表達(dá)。

［1］ Chow F Y，Nikolic-Paterson D J，et al．Monocyte chemoattractant protein-1 promotes the development of diabetic renal injury in streptozotocin-treated mice［J］．Kidney Int，2006，69(1):73-80．

［2］ 何勁松朱凌波畢禮明．氟伐他汀對(duì)糖尿病大鼠腎組織TGF-β1 表達(dá)的影響［J］．中國生化藥物雜志，2007，28(6):400-403．

［3］ Wada T，Yokoyama H，Matsushima K，et al．Monocyte chemoattractant protein-1:dose it play a role in diabetic nephropathy? ［J］Nephrol Dial Transplant，2003，18:457-459．

［4］ 劉冠賢，葉任高，譚志明，等 ．大黃素對(duì)狼瘡性腎炎成纖維細(xì)胞生物學(xué)形為的影響［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，20(3):196-198．

［5］ 王曉玲，王儉勤，夏延齡，等．大黃素對(duì)人腎成纖維細(xì)胞抑制作用的研究［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2002，11(3):629-631．

［6］ 楊俊偉，黎磊石，胡偉新，等．大黃素抑制腎代償性肥大的作用［J］．中國藥理學(xué)通報(bào)，1994，10(3):224-227．

［7］ 柯 凌．大黃的藥理及其在腎臟病中的運(yùn)用［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2001，6(2):347-348．

［8］ 寧英遠(yuǎn)，王儉勤．大黃素對(duì)人腎成纖維細(xì)胞增殖的影響［J］．中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2000，2(9):347-350．

Effect of emodin on expression of MCP-1 in renal tissue of diabetic rats

HE Jin-song，CAO Dong-wei
(Department of Nephrology，Nanjing Gulou Hospital，School of Medicine，Nanjing University，Nanjing 210008，China)

Purpose To investigate the effect of emodin on expression of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)in renal tissue of diabetic rats．Methods Diabetes was induced by injection of Streptozocin in Sprague-Dawley rats．Diabetic rats were treated with emodin for 8 weeks．Urinary protein excretion and plasma concentrations of creatinine were measured．The expression of MCP-1 was detected at protein and mRNA level in renal tissue．Results Increased urinary protein excretion in diabetic rats was attenuated through treatment with emodin．Overexpression of MCP-1 was observed in renal tissue of diabetic rats and was attenuated with emodin．Conclusion It is suggested that emodin may retard the progression of diabetic nephropathy by reducing expression of MCP-1．

emodin;diabetic;MCP-1;renal tissue

R285

A

1005-1678(2012)06-0795-03

2012-08-16

何勁松，男，教授，主任醫(yī)師，主要從事腎小球疾病發(fā)病機(jī)理的研究。