苯基乙炔磺酰胺與蓽撥酰胺抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用研究

王繼雙，何 焱，張文靜，張 鵬，黃啟來，華子春，2

(1．澳門科技大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院 澳門藥物與健康應(yīng)用研究所 中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，澳門 999078;2．南京大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 南京 210093)

苯基乙炔磺酰胺與蓽撥酰胺抗肺癌A549細(xì)胞增殖作用研究

王繼雙1，何 焱1，張文靜1，張 鵬1，黃啟來1，華子春1，2

(1．澳門科技大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院 澳門藥物與健康應(yīng)用研究所 中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室，澳門 999078;2．南京大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 南京 210093)

目的 探討HSP70抑制劑PFT-μ(苯基乙炔磺酰胺)及蓽撥酰胺單獨使用及合用時，對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖活性的影響。方法 MTT法檢測蓽撥酰胺、PFT-μ單用及合用對A549細(xì)胞增殖的影響;DAPI染色觀察A549細(xì)胞凋亡形態(tài)改變;Western blot法檢測相關(guān)凋亡蛋白PARP、Bid的變化。結(jié)果 蓽撥酰胺劑量依賴性抑制A549細(xì)胞增殖，兩藥合用顯著降低細(xì)胞增殖活性，與各單獨給藥組存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．01);兩藥合用后細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，但是凋亡現(xiàn)象沒有蓽撥酰胺組明顯;PFT-μ不引起相關(guān)凋亡蛋白變化。蓽撥酰胺降低Bid表達(dá)，增加PARP剪切體表達(dá)。與蓽撥酰胺組相比，合用增加Bid表達(dá)，減少PARP剪切體表達(dá)。結(jié)論 PFT-μ與蓽撥酰胺合用，能增加對A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性，但二者可能通過不同的方式促進(jìn)細(xì)胞死亡。

苯基乙炔磺酰胺;蓽撥酰胺;聯(lián)合用藥;PARP;Bid

蓽撥酰胺(piplartine)，又稱為蓽撥明堿，是一種生物堿類化合物，來源于胡椒科植物蓽撥的根，也存在于長柄胡椒和瘤突胡椒等的根中［5］。蓽撥酰胺有多種藥理學(xué)活性，能抑制血吸蟲的活動，并將其殺死［6］;能通過抑制 HL-60和 K562細(xì)胞的 DNA合成，發(fā)揮抗腫瘤的作用［7］;能使 PC-3細(xì)胞周期停滯［8］等。

苯基乙炔磺酰胺(2-phenylethynesulfonamide，PFT-μ，PES)，是一種HSP70抑制劑，能特異性地和HSP70相互結(jié)合［9］，通過影響HSP70的功能發(fā)揮抗腫瘤作用。

本文以非小細(xì)胞肺癌 A549細(xì)胞為模型，將PFT-μ與蓽撥酰胺單獨或者聯(lián)用，探討兩者合用是否能增強對A549細(xì)胞的抗增殖作用。

1 材料

蓽撥酰胺(純度≥90%)，法國Extrasynthese公司;PFT-μ(純度≥99%)，美國 Tocris Bioscience。實驗前，蓽撥酰胺溶于二甲亞砜(DMSO)，儲備液濃度為20．0 mmol/L;PFT-μ溶于DMSO，儲備液濃度為60．0 mmol/L，保存于 －20 ℃冰箱。

F-12K 培養(yǎng)基、胎牛血清 (FBS)、0．05%Trypsine-EDTA，美國Gibco公司;DAPI細(xì)胞凋亡檢測試劑，中國上海碧云天生物技術(shù)研究所;GAPDH鼠單克隆抗體，美國Santa Cruz Biotechnology;Bid兔單克隆抗體、PARP兔單克隆抗體，美國Cell Signaling Technology;Donkey-anti-Rabbit IRDye800CW、Goat-anti-Mouse IRDye800CW遠(yuǎn)紅外熒光二抗，美國Genentech公司。

人肺癌A549細(xì)胞株，美國模式培養(yǎng)集存庫(A-merican type culture collection，ATCC，美國)。

微孔板分光光度儀，美國Molecular Devices公司;倒置式熒光顯微鏡，日本Olympus公司;Odyssey近遠(yuǎn)紅外光分析儀，美國LI-COR Bioscience公司。

2 方法

2．1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A549細(xì)胞用含100 μg/mL鏈霉素，100 u/mL青霉素和10%FBS的 F-12K培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞80%融合時，用0．05%Trypsine-EDTA消化傳代。

2．2 實驗分組

首先考察蓽撥酰胺對A549細(xì)胞增殖活性的影響。10．0，15．0，20．0，25．0，30．0 μmol/L 蓽撥酰胺作用A549細(xì)胞24 h后檢測細(xì)胞活力。在后續(xù)實驗中根據(jù)蓽撥酰胺單獨使用的結(jié)果和文獻(xiàn)推薦的PFT-μ使用濃度［10］，分組:①不含藥液空白對照組;② 20．0 μmol/L PFT-μ;③20．0 μmol/L 蓽撥酰胺;④ 20．0 μmol/L PFT-μ +20．0 μmol/L 蓽撥酰胺。

首先我們觀察混合數(shù)據(jù)(pooled data)中各變量與主觀幸福度的相關(guān)性。由于OLS和Ordered model得到的結(jié)果并無實質(zhì)性差異(Ferrer-i-Carbonell and Frijters, 2004)，本文采用OLS方法得到混合回歸結(jié)果。從表2回歸結(jié)果中可以看出，健康、婚姻狀況、教育、工作、性別和年齡等人口學(xué)變量都對主觀幸福度有顯著影響。這一研究結(jié)論與幸福經(jīng)濟(jì)學(xué)文獻(xiàn)(如Easterlin，2002，溫曉亮等，2011)的研究結(jié)論基本一致。

2．3 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性

取對數(shù)生長期A549細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為 2．5 ×104/mL，以 100 μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，給予不同的藥液處理，設(shè)置4個平行孔，37℃，5%CO2條件下，繼續(xù)孵育24 h。孵育結(jié)束后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄上清，每孔加入DMSO 100 μL，于平板振蕩器上低速震蕩10 min，充分溶解甲瓚。用酶標(biāo)儀測定吸光度(A)值，檢測波長為570 nm，參比波長為650 nm。抑制率(%)=(1－A實驗/A對照)×100%。

2．4 DAPI染色

取對數(shù)生長期A549細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔5×104個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，按2．2項分組藥物處理，置于37℃，5%CO2條件下，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗兩遍，DAPI常溫避光染色15 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野。

2．5 Western blot檢測蛋白含量變化

取對數(shù)生長期的A549細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液后以3．5×105個/孔細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，按2．0項分組藥物處理24 h。藥物孵育結(jié)束后，棄上清，預(yù)冷PBS洗2遍，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液，收集細(xì)胞，置1．5 mL Eppendorf管中，冰浴靜置30 min，于4℃，12 000 r/min離心30 min，轉(zhuǎn)移上清至另一Eppendorf管中。Bradford法測定蛋白濃度。各組樣品加入4×上樣緩沖液后，100℃金屬浴加熱10 min使蛋白變性。于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白。隨后轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別進(jìn)行目的蛋白抗體GAPDH，PARP，Bid的孵育與檢測。用Odyssey Infrared Imaging System(LI-COR Biosciences，NE，USA)，設(shè)置分辨率為84 μm，遠(yuǎn)紅外通道為800 nm進(jìn)行蛋白信號的檢測。信號強度運用Odyssey system application(version 2．1)軟件進(jìn)行分析。

2．6 統(tǒng)計分析

各實驗均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用Graphpad prism 5．0軟件分析，多組間采用單因素方差分析，兩組間采用t檢驗，數(shù)據(jù)以(x±s)表示，P ＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3．1 PFT-μ與蓽撥酰胺合用，增加了對A549細(xì)胞增殖的抑制

結(jié)果見表1～2。蓽撥酰胺劑量依賴性抑制A549細(xì)胞的增殖。20．0 μmol/L蓽撥酰胺作用時，細(xì)胞抑制率為 49．36%;20．0 μmol/L PFT-μ 作用時，細(xì)胞抑制率為25．05%;當(dāng)兩藥聯(lián)合使用時，細(xì)胞的抑制率明顯提高，達(dá)62．96%，與兩種單藥的抑制率相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．01)，PFT-μ與蓽撥酰胺合用后，顯著降低A549細(xì)胞的增殖活性。

表1 蓽撥酰胺對A549細(xì)胞生長的抑制的作用(x ± s，n=3)Tab．1 Dose-dependent growth inhibition effect of piplartine on A549 cells(x ± s，n=3)

表2 PFT-μ、蓽撥酰胺及合用對A549細(xì)胞的影響(x ± s，n=3)Tab．2 The effect of PFT-μ or piplartine and their combination on A549 cells(x ± s，n=3)

3．2 PFT-μ與蓽撥酰胺合用促進(jìn)細(xì)胞死亡，但細(xì)胞凋亡減弱

結(jié)果見圖 1。A549 細(xì)胞在 20．0 μmol/L PFT-μ，20．0 μmol/L蓽撥酰胺以及兩藥聯(lián)合作用24 h后，用DAPI對細(xì)胞進(jìn)行染色，倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。對照組的細(xì)胞形狀規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻。PFT-μ組沒有引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生。蓽撥酰胺組的細(xì)胞核數(shù)目減少，細(xì)胞核皺縮，細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚，出現(xiàn)不規(guī)則的形狀。聯(lián)合給藥后，細(xì)胞核數(shù)目減少更多，但是細(xì)胞核皺縮沒有蓽撥酰胺單用時嚴(yán)重。

3．3 Western blot法檢測蛋白含量的改變，合用降低了細(xì)胞凋亡的發(fā)生

結(jié)果見圖2～3。PFT-μ對細(xì)胞內(nèi)的PARP，Bid影響不明顯。蓽撥酰胺作用后，PARP出現(xiàn)了明顯的剪切體，是對照組的(13．66 ±5．56)倍，與對照組相比有顯著性差異(P＜0．05)。Bid條帶明顯減弱，降低為對照組的(64．28±8．13)%，與對照組相比有顯著性差異(P＜0．01)。合用組兩個蛋白也發(fā)生了改變，但與蓽撥酰胺組相比，Bid有輕微的增加，表達(dá)量為對照組的(70．70±14．39)%，PARP剪切體也有所減少，為對照組的(9．61±6．54)倍，合用減弱了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

圖1 PFT-μ、蓽撥酰胺以及合用對A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig．1 The effect of PFT-μ、piplartine and their combination on the morphological changes in A549 cells

4 討論

細(xì)胞凋亡是一種程序性的細(xì)胞死亡方式，通過細(xì)胞凋亡，機體可以消除損傷、衰老或者突變的細(xì)胞［11］。在凋亡信號的刺激下，Bax轉(zhuǎn)位到線粒體，在線粒體上形成寡聚體［12］。Bid經(jīng)過caspase-8水解成tBid，tBid與Bax寡聚體相互作用使其構(gòu)象改變，插入線粒體膜，引起線粒體跨膜電位下降［13］，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與Apaf-1結(jié)合，招募procaspase-9形成復(fù)合物，并將其活化，活化的caspase-9激活下游的procaspase-3，caspase-3能夠剪切底物蛋白加速凋亡過程，如PARP。賽燕等［14］的研究表明，PARP是細(xì)胞內(nèi)有效監(jiān)測DNA損傷的分子感受器，有修復(fù)DNA損傷的作用，被剪切失活后，不能修復(fù)損傷的DNA，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡。

圖2 PFT-μ、蓽撥酰胺及合用對PARP的影響Fig．2 The effect of PFT-μ，piplartine and combination treatment on the protein PARP

蓽撥酰胺對細(xì)胞有毒性，且呈劑量依賴性，處理細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的PARP剪切體，與Kong等［8］的研究結(jié)果一致，PARP的蛋白酶解被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的一個早期分子標(biāo)志［14］。并且細(xì)胞中促凋亡蛋白Bid明顯降低，推測蓽撥酰胺引發(fā)線粒體凋亡通路時Bid被剪切為tBid參與了凋亡的發(fā)生。然而有趣的是，我們在檢測中發(fā)現(xiàn)，兩藥合用后，較蓽撥酰胺組Bid的表達(dá)量增多，PARP剪切體減少。合用使蓽撥酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡減少，和DAPI染色觀察到的現(xiàn)象相符。

圖3 PFT-μ、蓽撥酰胺及合用對Bid的影響Fig．3 The effect of PFT-μ，piplartine and combination treatment on the protein Bid

在 Leu等［15］的研究中，PFT-μ 雖然導(dǎo)致了60%以上的細(xì)胞死亡，但是，未觀察到caspase-3、caspase-8、PARP剪切體的出現(xiàn)，與本文的結(jié)果相似。研究還表明，順鉑與PFT-μ聯(lián)用后，原本順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞caspase-3、caspase-8剪切體也被抑制。其原因之一可能是當(dāng)PFT-μ與HSP70結(jié)合后，抑制了HSP70與p53的結(jié)合，影響了p53在線粒體的聚集，導(dǎo)致p53不能和線粒體上的Bak、Bax相互作用，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。PFT-μ還能干擾HSP70與Apaf-1的相互作用，降低細(xì)胞凋亡。Leu等［15］證明，PFT-μ導(dǎo)致的細(xì)胞毒性是由于PFT-μ阻礙了HSP70和溶酶體蛋白的相互作用，擾亂了溶酶體的功能，使細(xì)胞的自噬作用功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞走向死亡。

PFT-μ與蓽撥酰胺合用顯著降低了A549細(xì)胞的增殖活性，其原因是因為PFT-μ影響了蓽撥酰胺誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路，使A549細(xì)胞選擇了其它的死亡方式。PFT-μ和蓽撥酰胺聯(lián)合抗腫瘤的效果具有較好的潛在應(yīng)用前景、其聯(lián)合抗腫瘤的作用機制還有待更深入的研究。

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The anti-proliferative effect of PFT-μ and piplartine on human lung cancer cell line A549

WANG Ji-shuang1，HE Yan1，ZHANG Wen-jing1，ZHANG Peng1，HUANG Qi-lai1，HUA Zi-chun1，2
(1．The State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine，F(xiàn)aculty of Traditional Chinese Medicine and Macau Institute for Applied Research in Medicine and Health，F(xiàn)aculty of Chinese Medicine，Macau University of Science and Technology，Macau 999078，China;2．The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology，Nanjing University，Nanjing 210093，China)

Purpose To determine the anti-proliferative activity of PFT-μ or piplartine and their combination on human lung cancer cell line(A549)．Methods The cell viability was analyzed by MTT assay．The apoptotic morphology was examined by DAPI staining．The PARP，Bid protein expression was determined by Western blot analysis．Results The anti-proliferation of piplartine had a dose-effect relationship．The combinational treatment significantly reduced the proliferation of the cells and the anti-proliferative effect of the combination group was significantly different from both the PFT-μ group and the piplartine group(P ＜0．01)．Compared with the piplartine group，the apoptotic morphological changed in the combination group was decreased．PFT-μ treatment had no influence on PARP and Bid protein expression．Piplartine significantly reduced Bid protein expression，and induced more PARP cleavage than the control group．Compared with the piplartine group，combination treatment decreased Bid protein expression and induced less PARP cleavage．Conclusion Combination treatment of PFT-μ and piplartine exhibited more potent anti-proliferative effect and this may be attributed to other cell death mechanism than apoptosis．

PFT-μ;piplartine;combination treatment;PARP;Bid

R961

A

1005-1678(2012)06-0754-05

2012-08-08

澳門科技發(fā)展基金(071/2009/A3，091/2009/A)

王繼雙，女，在讀碩士研究生，E-mail:wjsddu@sina．com; 華子春，通信作者，E-mail:huazc@nju．edu．cn; 黃啟來，通信作者，E-mail:biocentury@gmail．com。