99Tcm-Syt I-C2A突變體蛋白在心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡顯像中的應(yīng)用

錢麗娟，周俊東，方緯，吳錦昌

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇蘇州 215001;2.阜外心血管病醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100037)

99Tcm-Syt I-C2A突變體蛋白在心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡顯像中的應(yīng)用

錢麗娟1，周俊東1，方緯2，吳錦昌1

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇蘇州 215001;2.阜外心血管病醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，北京 100037)

目的探討99Tcm標(biāo)記突觸結(jié)合蛋白I-C2A片段突變體(99Tcm-Syt I-C2A-G4C)在心肌凋亡顯像中的應(yīng)用。方法(1)采用亞錫還原法制備99Tcm-Syt I-C2A-G4C。99Tcm-Syt I-C2A-G4C經(jīng)純化后通過紙層析法測(cè)定放化純;細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定99Tcm-Syt I-C2A-G4C與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合能力。(2)選用5頭小豬制備心肌缺血-再灌注損傷模型，靜脈注射99mTc-Cyt-C2A-G4C 2 h后進(jìn)行圖像采集，計(jì)算心肌異常高放射性區(qū)/本底(T/B)比值;同時(shí)使用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)分析損傷心肌中細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果(1)標(biāo)記后的99Tcm-Syt I-C2A-G4C放射化學(xué)純度為(96.42±0.76)%;(2)99Tcm-Syt I-C2A-G4C與喜樹堿處理組細(xì)胞結(jié)合測(cè)定的放射性計(jì)數(shù)是未處理組細(xì)胞的5.23±0.38倍;(3)99mTc-Cyt-C2A-G4C注射后2 h，心肌部位可見明顯的局部放射性異常濃聚，T/B比值為3.40± 0.43;高放射性心肌組織標(biāo)本，TUNEL染色亦可見大量黃染的凋亡細(xì)胞。結(jié)論99Tcm-Syt I-C2A-G4C可用于心肌細(xì)胞凋亡顯像。

心肌缺血再灌注;凋亡顯像;突觸結(jié)合蛋白I;锝

心肌缺血再灌注是一復(fù)雜病理過程，包括缺血及再灌注兩次損傷。缺血可引起能量代謝障礙及鈣離子超負(fù)荷，再灌注可引起氧自由基生成，引發(fā)缺血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡［1］。近來研究表明，缺血再灌注后，心肌細(xì)胞凋亡可能導(dǎo)致心肌梗死面積擴(kuò)大［2］。因此，有效地監(jiān)測(cè)心肌缺血再灌注過程中的細(xì)胞凋亡，可能對(duì)預(yù)防心肌梗死面積擴(kuò)大及改善心功能具有重要意義。神經(jīng)突觸結(jié)合蛋白I (synaptotagmin I)是神經(jīng)細(xì)胞突觸囊泡上的一種整合膜蛋白，其C2A片段(Syt I-C2A)在鈣離子存在下，可與帶負(fù)電的膜磷脂(如磷脂酰絲氨酸)結(jié)合，近來一些研究顯示99Tcm-Syt I-C2A蛋白可用于細(xì)胞凋亡核素顯像［3－4］。然而在實(shí)際的應(yīng)用中，我們發(fā)現(xiàn)99Tcm-Syt I-C2A分子相對(duì)較大(相對(duì)分子質(zhì)量36 000)，血液清除較慢，肝臟濃聚較多，用于心臟成像存在很多局限性［3－5］。為了優(yōu)化Syt I-C2A的核素顯像質(zhì)量，我們通過基因工程的方法重組Syt IC2A蛋白的突變體(Syt I-C2A-G4C)，即去除了C2A片段C端的谷氨酸和賴氨酸，增加4個(gè)甘氨酸和1個(gè)半胱氨酸，擬增加Syt I-C2A在血液中清除速度，減少其在肝臟積聚，以便更利于心肌成像。本研究主要探討99Tcm標(biāo)記的Syt I-C2A突變體蛋白Syt IC2A-G4C在心肌凋亡顯像中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 99Tcm標(biāo)記Syt I-C2A-G4C

Syt I-C2A-G4C融合蛋白干粉由阜外醫(yī)院方緯副教授提供;采用亞錫還原法標(biāo)記蛋白，標(biāo)記方法參見文獻(xiàn)［6］。標(biāo)記后產(chǎn)物使用紙層析法測(cè)定放射性化學(xué)純度，支持物為ITLC-SG，展開劑分別為生理鹽水和氨水∶乙醇∶水(1∶2∶5)。

1.2 99Tcm-Syt I-C2A-G4C活性檢測(cè)

方法參考文獻(xiàn)［7］，簡(jiǎn)述如下:用終濃度為3 μmol/L喜樹堿(購(gòu)于Sigma公司)處理Jurket細(xì)胞(購(gòu)于中科院細(xì)胞所)3 h，收獲細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×1010個(gè)/L。取100 μl上述細(xì)胞懸液和正常Jurket細(xì)胞各3管，分別加入80 nmol/L99Tcm-Syt IC2A-G4C溶液，靜置冰上反應(yīng)5 min，洗滌3次，棄上清，留沉淀，分別用γ計(jì)數(shù)儀(FT609，購(gòu)于北京四新科技開發(fā)公司)測(cè)定放射性計(jì)數(shù)。

1.3 動(dòng)物模型的制備

選用5只中華小型豬(由南京軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)制備心肌缺血-再灌注損傷誘導(dǎo)心肌凋亡模型。以3%戊巴比妥鈉麻醉后，股動(dòng)脈穿刺，插入6F球囊導(dǎo)管，在X線血管造影指導(dǎo)下，置于冠狀動(dòng)脈左前降支或左回旋支的中遠(yuǎn)端，球囊充氣，阻塞血流30 min后，減壓，撤去導(dǎo)管，造成心肌缺血再灌注損傷，全程心電監(jiān)測(cè)。

1.4 心肌凋亡顯像

動(dòng)物模型制備成功后1 h，予以靜脈注射99mTc-Cyt-C2A-G4C 10 mCi，注射2 h后進(jìn)行圖像采集。首先進(jìn)行CT定位掃描，每層掃描15 s，共掃描40層。隨后進(jìn)行SPECT顯像，能峰140 keV，能窗20%，圖像矩陣128×128，每6°采集1幀圖像，共采集60幀圖像，每幀采集45 s。OSEM軟件迭代重建后，分別得到SPECT和CT圖像，再進(jìn)行SPECT圖像與CT定位的融合。用勾畫“感興趣”區(qū)(ROI)的方法計(jì)算心肌異常高放射性區(qū)/本底(T/B)比值。顯像結(jié)束后處死動(dòng)物，取出心臟，根據(jù)顯像定位和大體觀察確定病變心肌部位，分別取病變心肌和正常心肌標(biāo)本，稱重并測(cè)定放射性計(jì)數(shù)，同時(shí)使用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)分析損傷心肌中細(xì)胞凋亡情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)之間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

應(yīng)用亞錫還原法標(biāo)記后的產(chǎn)物，經(jīng)Sephadex G25純化后，用紙層析法測(cè)定的放射性化學(xué)純度為(96.42±0.76)%，放射性膠體量小于5%。

喜樹堿處理后，Jurket細(xì)胞凋亡率為30%～50%。99Tcm-Syt I-C2A-G4C與喜樹堿處理組細(xì)胞結(jié)合測(cè)定的放射性計(jì)數(shù)是未處理組細(xì)胞的(5.23± 0.38)倍，表明99Tcm標(biāo)記后的Syt I-C2A突變體Syt I-C2A-G4C仍保持結(jié)合PS的能力。

3 頭實(shí)驗(yàn)豬心肌缺血再灌注模型制備成功，2頭豬死于嚴(yán)重心律失常。99mTc-Cyt-C2A-G4C注射后2 h，左側(cè)下側(cè)壁可見明顯的局部放射性異常濃聚(圖1)，T/B比值為3.40±0.43(n=3，t=8.53，P＜0.01)。顯像后立即處死動(dòng)物，取出心臟，根據(jù)顯像定位和大體觀察確定病變心肌部位，分別稱取病變心肌和正常心肌標(biāo)本重量，并測(cè)定放射性計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷心肌與正常心肌的單位質(zhì)量放射性比值為7.98±1.47(n=3，t=10.12，P＜0.01)。高放射性心肌組織標(biāo)本經(jīng)TUNEL染色亦可見大量黃染的凋亡細(xì)胞(圖2)。

圖1 99mTc-Cyt-C2AG4C心肌凋亡顯像(SPECT+定位CT融合成像)

圖2 心肌組織病理形態(tài)(TUNEL染色×40)

3 討論

細(xì)胞凋亡在心臟疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中具有重要的作用，如急性心肌梗死后早期，心肌缺血再灌注損傷是觸發(fā)心肌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素，細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞的主要死亡形式，也是梗死范圍擴(kuò)大的獨(dú)立預(yù)后因子;在心肌炎病例，心肌細(xì)胞凋亡增多是心肌炎發(fā)展為擴(kuò)張型心肌病，進(jìn)而發(fā)展為心衰的重要機(jī)制之一。鑒于心肌細(xì)胞凋亡在心臟疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中的重要地位，通過阻斷、干預(yù)凋亡進(jìn)行治療的策略逐步得到廣泛的接受。近年來，國(guó)內(nèi)外均已開展了多項(xiàng)抗凋亡治療的研究，主要針對(duì)細(xì)胞凋亡的誘發(fā)因素、激活通路和凋亡調(diào)控基因等［8］。隨著心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制及抗凋亡治療研究的不斷深入，如何有效地?zé)o創(chuàng)性檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡，從而為相關(guān)心臟疾病的早期診斷、預(yù)后評(píng)價(jià)以及抗凋亡治療的療效監(jiān)測(cè)提供可靠的方法，已成為國(guó)際上普遍關(guān)注和迫切需要解決的問題。目前普遍認(rèn)為，分子成像技術(shù)，如放射性核素顯像、MRI和光學(xué)成像等的研究，有助于解決這一難題。而在上述分子影像技術(shù)中，放射性核素細(xì)胞凋亡顯像是目前相對(duì)較為成熟的方法。

細(xì)胞凋亡分子成像技術(shù)的關(guān)鍵是選擇合適的靶點(diǎn)和高度特異性的分子探針。針對(duì)凋亡細(xì)胞的不同靶點(diǎn)，目前用于細(xì)胞凋亡成像的分子探針可以分為四類。第一類針對(duì)磷脂酰絲氨酸(PS)，正常細(xì)胞的PS位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)，PS翻轉(zhuǎn)至胞膜外側(cè)，成為吞噬細(xì)胞清除的信號(hào)。由于PS暴露于細(xì)胞表面，在刺激因素作用的最初數(shù)小時(shí)內(nèi)凋亡即可發(fā)生，且PS含量豐富，每個(gè)凋亡細(xì)胞有超過百萬個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，因此，受到廣泛的關(guān)注，也是目前研究最多的成像結(jié)合靶點(diǎn)。第二類分子探針是針對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Caspase家族蛋白酶，其中Caspase-3最為重要［9］。Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮作用。第三類是針對(duì)線粒體跨膜電位變化的分子探針?？缒る娢粚?duì)維持線粒體的正常功能至關(guān)重要，正常細(xì)胞線粒體跨膜電位為內(nèi)負(fù)外正，能夠高度攝取某些親脂陽(yáng)離子物質(zhì)［10］。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，由于線粒體膜通透性增加，跨膜電位降低，因此攝取親脂陽(yáng)離子物質(zhì)的能力明顯降低。第四類為一些機(jī)制尚不明確的分子探針，如小分子肽NST-732等，Aloya等［11］通過嚙齒動(dòng)物熒光成像實(shí)驗(yàn)證實(shí)NST-732能夠被不同的凋亡組織選擇性攝取。

Syt I-C2A是一種鈣離子依賴的與凋亡細(xì)胞表面磷脂酰絲氨酸(PS)特異性結(jié)合的物質(zhì)，曾多次報(bào)道被用于心肌凋亡顯像。然而我們研究組在實(shí)際的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)該蛋白血液清除較慢(大鼠體內(nèi)的生物半排期約為15 min)，且在肝臟積聚較多，限制了其用于心肌顯像。為了進(jìn)一步優(yōu)化該顯像劑，我們研究組成員方緯副教授通過基因工程的方法去除了C2A片段C端的谷氨酸和賴氨酸，增加4個(gè)甘氨酸和1個(gè)半胱氨酸，命名為Syt I-C2AG4C，并在大鼠體內(nèi)測(cè)定該蛋白的生物半排期＜10 min。

盡管體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定該突變體蛋白與喜樹堿誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞結(jié)合能力明顯下降，但仍保持結(jié)合PS的能力。在心肌缺血再灌注動(dòng)物模型中，靜脈注射99mTc-Cyt-C2A-G4C 2 h后，可得到較高質(zhì)量的圖像，且TUNEL分析顯示放射性濃聚部位的心肌凋亡細(xì)胞明顯增加。因此，我們推測(cè)Syt I-C2A-G4C可用于心肌細(xì)胞凋亡核素顯像。

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Application of99Tcm-Syt I-C2A in apoptosis imaging of cardiocytes based on myocardial ischemia-reperfusion

QIAN Li-juan1，ZHOU Jun-dong1，F(xiàn)ANG Wei2，WU Jin-chang1

(1.Department of Cardiology，Suzhou Hospital Affiliated to Nanjing Medical University，Suzhou Jiangsu 215001;2.Department of Nuclear Medicine，F(xiàn)uwai Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100037，China)

ObjectiveTo investigate application of mutation protein of C2A domain of synaptotagmin I(Syt IC2A-G4C)labeled with technetium in myocardial apoptosis imaging.Methods(1)The C2A domain of Syt I was labeled with99Tcmusing reduction photometry of Tin chloride.Radiochemical purity was determined with thin layer chromatography.The binding activity with phosphatidylserine of radiolabeled protein was assessed using cell binding experiment.(2)Myocardial ischemia-reperfusion models were produced in 5 pigs.SPECT images were acquired at 2h after post injection of99mTc-Cyt-C2A-G4C via the tail，and the ratio of target/background was also calculated using region of interest(ROI)method.Apoptosis in the ischemic myocardium was assessed using terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay.Results(1)The radiochemical purity of99Tcm-Syt I-C2A-G4C was(96.42±0.76)%.(2)The radioactivity in the camptothecin-treated group was (5.23±0.38)folds higher than that of non-treated viable control group.(3)At 2 h post-injection of the radiotracer，the focal uptake of radioactivity was observed at the ischemic myocardium areas，and T/B ratio was 3.40± 0.43.Myocardial apoptosis was confirmed by TUNEL assay in the ischemic myocardium with high radioactivity.Conclusion99Tcm-Syt I-C2A-G4C should be a potential radiotracer for imaging of myocardial apoptosis.

myocardial ischemia-reperfusion;apoptosis imaging;Synaptotagmin I;Technetium

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金資助項(xiàng)目(NY0714);蘇州市科技局社會(huì)發(fā)展基金資助項(xiàng)目(SZD0894)和蘇州市科技計(jì)劃興衛(wèi)青年科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(SWKQ0818)。

R542.2

A

1008-0740(2012)02-0082-03