黑曲霉液體發(fā)酵桔粉產(chǎn)纖維素酶的研究*

董 基 劉 釗

（肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，肇慶 526061）

黑曲霉液體發(fā)酵桔粉產(chǎn)纖維素酶的研究*

董 基**劉 釗

（肇慶學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，肇慶 526061）

以桔粉為原料，以黑曲霉（Aspergillus niger）為發(fā)酵菌株，采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶。通過單因素試驗考查了麩皮和蛋白胨的比例（C/N）、裝液量及接種量3個因素對產(chǎn)酶的影響，并在此基礎(chǔ)上，通過正交試驗確定了發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件為：添加桔粉80 g/L，麩皮和蛋白胨質(zhì)量比為1∶2、250 mL三角瓶裝30 mL Mandels氏營養(yǎng)液、接種量3 mL，于30℃下培養(yǎng)72 h，纖維素酶產(chǎn)量達到1885.71 U/g。

桔粉；黑曲霉；液體發(fā)酵；纖維素酶

纖維素酶是具有降解含有β-1，4糖苷鍵的纖維素的一組酶的總稱，廣泛應(yīng)用于釀造果汁與蔬菜加工、糧食加工、飼料、造紙、中草藥有效成分的提取、紡織、采油工程、廢水處理以及能源制造等各個方面。我國是柑桔生產(chǎn)大國，每年都會產(chǎn)生很大一部分落果和滯銷果，這部分廢棄柑桔一般都是直接扔棄，既浪費了資源，又污染了環(huán)境。

柑桔富含果膠、纖維素、可溶性糖及多種維生素和礦物元素，是一種良好的微生物生長基質(zhì)。黑曲霉是公認安全（GRAS） 的微生物，用其生產(chǎn)酶制劑安全、可靠，不產(chǎn)生毒素，而且生長快、發(fā)酵周期短，具有明顯的優(yōu)越性。利用黑曲霉液體發(fā)酵柑桔產(chǎn)纖維素酶目前未見報道。本文通過黑曲霉液體發(fā)酵桔粉產(chǎn)纖維素酶的研究，旨在為纖維素酶的液體發(fā)酵生產(chǎn)提數(shù)據(jù)參考，也為廢棄柑桔的綜合利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

桔子落果，本地桔園獲得，無腐爛，將其烘干磨成粉末，備用。

黑曲霉（Aspergillus niger）：本院微生物試驗室保藏。

1.2 儀器設(shè)備

UV-1801紫外/可見分光光度計，北京北分瑞利分析儀器公司；PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械一廠；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市鑫諾試驗儀器廠；DHG-9070B數(shù)顯電熱恒溫干燥箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；DGX-9143B-1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海?，斣囼炘O(shè)備有限公司；YX280AS手提式不銹鋼蒸汽消毒器，上海三申醫(yī)療器械有限責(zé)任公司；BS-1E恒溫振蕩培養(yǎng)箱，金壇市恒豐儀器廠。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 營養(yǎng)液

Mandels氏營養(yǎng)液。

1.3.2 斜面培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 200 g，葡萄糖5 g，KH2PO41 g，水1000 mL，自然pH，瓊脂5 g。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基

產(chǎn)纖維素酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：柑桔粉80 g/L，其他組分按照單因素試驗方案進行配置，pH 6.5。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：將培養(yǎng)好的新鮮產(chǎn)孢子斜面上的孢子制備成孢子懸液，按培養(yǎng)基體積10%(約1.2×108個孢子)接種到產(chǎn)纖維素酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.4 主要試劑

3，5-二硝基水楊酸（DNS） 試劑：取酒石酸鉀鈉182 g，溶于500 mL蒸餾水中，加熱。于熱溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸6.3 g，氫氧化鈉10 g，苯酚5 g，無水亞硫酸鈉5 g，攪拌至溶解，冷卻后用蒸餾水定容至1000 mL，混勻，過濾，貯于棕色試劑瓶中，于暗處放置72 h后使用。

檸檬酸緩沖液（pH 4.8，0.05 mol/L）：取40 mL 0.1mol/L檸檬酸與60 mL 0.1 mol/L檸檬酸三鈉混合，再加200 mL蒸餾水稀釋一倍。

1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 溶液：稱取1 g羧甲基纖維素鈉，精確至1 mg，緩緩加入pH為4.8的檸檬酸緩沖液80 mL，水浴加熱至全部溶解。攪拌均勻，冷卻后定容至1000 mL，再用二層紗布過濾。此溶液在4℃冰箱貯存，有效期為3 d。

1 g/100mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：稱取預(yù)先于（103±2） ℃下干燥至恒重的葡萄糖1.000 g，用蒸餾水溶解后定容至100 mL，即為1 g/100 mL濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5 方法

1.5.1 纖維素酶活力測定

采用DNS法。

1.5.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別配制 0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL、1200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖使用溶液，各吸取0.50 mL于試管中，同時分別吸取檸檬酸緩沖液1.5 mL、DNS試劑3.0 mL于上述試管中，混勻。將試管置于沸水浴中，反應(yīng)7 min，取出，迅速冷卻至室溫，準(zhǔn)確加入蒸餾水10 mL，混勻。用10 mm比色杯，以空白管(對照液)調(diào)儀器零點，在分光光度計λ=540 nm處測吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程。相關(guān)系數(shù)R2應(yīng)在0.999 0以上時方可使用(否則須重做)。

1.5.3 酶活力計算

纖維素酶活力按下式計算：

式中：X——纖維素酶活力，U/g；

A——根據(jù)吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得（或從回歸方程計算出） 的還原糖生成量，μg/mL；

V——樣品提取時加入水的量，mL；

N——樣品二次稀釋時的稀釋倍數(shù)；

0.5——參與反應(yīng)的酶量，g；

W——樣品量，g；

10——反應(yīng)時間，min。

1.5.4 試驗設(shè)計

1.5.5.1 單因素試驗

分別考察麩皮和蛋白胨的質(zhì)量比（C/N）（A）、裝液量（B） 及接種量（C） 三個重要因素對產(chǎn)酶的影響。

1.5.4.2 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，進行3因素3水平正交試驗，采用L9（34）正交表，對試驗結(jié)果進行極差分析，通過極差分析確定方案。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

按1.5.2中的方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：D（λ） =0.000 2ρ+0.040 2，R2=0.999 6。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6，大于0.999 0，說明回歸方程擬合良好，因此可以使用該葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 麩皮和蛋白胨的質(zhì)量比（C/N）對產(chǎn)酶的影響

將麩皮（輔助碳源） 與蛋白胨（氮源） 按不同質(zhì)量比混合成同質(zhì)量濃度（6 g/mL固形物）的培養(yǎng)基。取30 mL Mandels氏營養(yǎng)液于250 mL三角瓶中，做7次試驗，加入麩皮與蛋白胨不同質(zhì)量比的混合物，分別為0∶6、1∶5、1∶2、1∶1、2∶1、5∶1、6∶0，然后置于30℃下振蕩培養(yǎng)72 h，收獲后測定酶活力。麩皮與蛋白胨的質(zhì)量比對纖維素酶產(chǎn)量的影響見表1。

表1 麩皮與蛋白胨不同質(zhì)量比對產(chǎn)酶的影響

表1表明，麩皮（輔助碳源） 與蛋白胨（氮源） 按1∶2的質(zhì)量比混合使用，更有利于酶產(chǎn)量的提高。氮源是黑曲霉生長必需的，麩皮作為輔助碳源，可供菌體早期迅速生長并促進產(chǎn)酶，故選用高氮低輔助碳的培養(yǎng)基較為適合。

2.3 裝液量對產(chǎn)酶的影響

在250 mL的三角瓶中分別加入20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL的Mandels氏營養(yǎng)液(發(fā)酵液)，按80 g/L加入桔粉、按6 g/100 mL加入麩皮及蛋白胨組成培養(yǎng)基，并接入等量的孢子，置于30℃下振蕩培養(yǎng)72 h，收獲后測定酶活力。不同裝液量對黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的影響見圖2。

圖2 裝液量對產(chǎn)酶的影響

圖2表明，裝液量30 mL黑曲霉產(chǎn)纖維素酶的產(chǎn)量最高。由30 mL至60 mL來看，隨著裝液量的增加，酶活力減少，說明黑曲霉的生長和產(chǎn)酶的多少都與通氣量有很大關(guān)系；裝液量為20 mL時酶活力比裝液量為60 mL時的要高，這是因為發(fā)酵培養(yǎng)過程中一直處于恒溫狀態(tài)，會導(dǎo)致部分失水，所以對發(fā)酵過程造成一定的影響。因此最佳裝液量選擇30 mL。

2.4 接種量對產(chǎn)酶的影響

分別在裝好桔粉和麩皮蛋白胨混合物的250 mL三角瓶中加入30 mL Mandels氏營養(yǎng)液，再分別接入1.5 mL、3 mL、4.5 mL、6 mL、7.5 mL種子液，然后置于30℃下振蕩培養(yǎng)，進行發(fā)酵培養(yǎng)72 h，收獲后測定酶比活力。接種量對產(chǎn)酶的影響如圖3所示。

圖3 接種量對產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，當(dāng)接種量為Mandels氏營養(yǎng)液體積的10%時，黑曲霉的產(chǎn)酶量最高；接種量大于15%時，酶活力開始下降。這說明在一定的環(huán)境條件下，底物量一定時，微生物種群達到一定數(shù)量將會對其本身產(chǎn)生抑制作用，對其生長和產(chǎn)酶都有一定程度的不利影響，故選擇10%接種量為佳（即接種量為3 mL）。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗

在單因素影響發(fā)酵產(chǎn)酶的研究基礎(chǔ)上，以發(fā)酵培養(yǎng)基的麩皮和蛋白胨質(zhì)量比、裝液量及接種量3因素作為影響黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的主要的因子，設(shè)計3因素3水平的正交試驗，采用L9（34）表，因素水平設(shè)計見表2，試驗結(jié)果見表3。

表2 因素水平表

表3 正交試驗結(jié)果

極差分析表明，各因素對產(chǎn)酶影響的主次順序為：A＞C＞B，最優(yōu)水平為A1C1B1，即麩皮和蛋白胨質(zhì)量比為1∶2，接種量為3 mL，裝液量為30 mL。此方案在正交試驗范圍內(nèi)，此條件下所得酶活力為1 885.71 U/g。

3 結(jié)論

以黑曲霉為試驗材料，采用液體發(fā)酵法，考察發(fā)酵桔粉產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：添加柑桔粉80 g/L、麩皮和蛋白胨質(zhì)量比為1∶2（6 g/100 g固形物）、250 mL三角瓶裝30 mL Mandels氏營養(yǎng)液、接種量3 mL，于30℃下培養(yǎng)72 h，纖維素酶產(chǎn)量達到最高。研究表明，黑曲霉可作為纖維素酶生產(chǎn)的優(yōu)良菌種。

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Study on production of celluase by Aspergillus niger with orange powder by liquid fermentation

DONG Ji**LIU Zhao
（College of chemistry and chemical engineering of Zhaoqing university，Zhaoqing 526061，China）

With orange powder as raw materials and Aspergillus niger as production strains，cellulase was producted by liquid fermentation.Three important factors of ratio of bran and peptone （C/N），liquid volume in flask，and inoculums size on cellulose activities were researched respectively by single factor test.Based on it，the enzyme production conditionswereoptimized by orthogonal test.The optimum conditions of enzyme production were adding 80 g/L orange powder，1∶2 ratio of bran and peptone，adding 30 mL Mandels nutrient solution to 250 mL flask，3 mL inoculums size，culturing 72 h at the temperature of 30 ℃.Activities of cellulase producted on the above conditions were 1885.71 U/g.

orange powder；Aspergillus niger；liquid fermentation；cellulase

TS201.3

A

1673-6004（2012）01-0034-04

肇慶學(xué)院自然科學(xué)青年項目（No.201106）

** 董基，女，1973年出生，1994年畢業(yè)于肇慶學(xué)院食品科學(xué)與工程專業(yè)，實驗師

2011-09-25