石蒜核糖體蛋白L21的基因克隆及氨基酸序列分析

佟金鳳，汪 仁，李曉丹，江玉梅，彭 峰，夏 冰

〔江蘇省·中國科學院植物研究所（南京中山植物園）江蘇省植物遷地保護重點實驗室，江蘇 南京 210014〕

核糖體是細胞進行蛋白質(zhì)合成的重要場所，通過解碼mRNA，與tRNA協(xié)同作用合成相應的蛋白質(zhì)。一般來說，真核生物的核糖體為80S，由40S和60S2個亞基組成，含3～4種RNA和80多種蛋白質(zhì)［1］。核糖體組裝過程可分為3步：首先在細胞質(zhì)中合成核糖體蛋白并運送到細胞核內(nèi)；在核仁內(nèi)，核糖體蛋白與rRNA組裝成核糖體；組裝完成的核糖體被運送到細胞質(zhì)中，經(jīng)過后期加工形成成熟的具有功能的核糖體［2-4］。研究結(jié)果表明：很多核糖體蛋白除具有組成核糖體和參與蛋白質(zhì)生物合成的功能外，還具有參與復制、轉(zhuǎn)錄加工、翻譯調(diào)控、DNA修復、耐藥性形成、自體翻譯、調(diào)控細胞凋亡和正常細胞的惡性轉(zhuǎn)化及發(fā)育調(diào)控等作用［5-7］。核糖體蛋白L21（RPL21）是位于真核生物60S亞基上的蛋白質(zhì)，其具體功能迄今為止仍未得到很好的闡釋，目前已在GenBank登錄的RPL21超過千條，主要來源于動物和微生物，來源于植物尤其是高等植物的RPL21尚不多見。

石蒜〔Lycoris radiata（L′Hér.）Herb.〕體內(nèi)所含的加蘭他敏可用于治療阿爾茨海默氏病和小兒麻痹癥等疾?。?］。目前，有關(guān)石蒜的研究較多，作者所在課題組對石蒜也進行了遺傳多樣性分析、cDNA文庫建立及總RNA提取方法等方面的研究［9-11］，但對石蒜RPL21尚無研究報道。作者根據(jù)來源于其他植物的已知RPL21的氨基酸序列，借助生物信息學技術(shù)和PCR技術(shù)篩選cDNA文庫的方法擴增石蒜RPL21基因的cDNA序列，并對擴增序列進行測序分析，以期為石蒜RPL21及其基因的功能研究提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所用的石蒜葉片全長cDNA文庫為本實驗室采用發(fā)芽20 d的石蒜嫩葉建立的cDNA文庫［10］；供試的宿主菌為大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，質(zhì)粒為pDNR-LIB。

實驗用 TRIzol○RReagent購自 Invitrogen公司；DNA Marker DL2000、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、pMD18-T Vector和所有限制性內(nèi)切酶均購自Takara公司；DNA純化回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

實驗儀器有AIR TECH超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、PCR儀（德國Eppendorf公司生產(chǎn)）、電熱恒溫隔水式精密培養(yǎng)箱（上海天恒醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)）、全溫振蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠生產(chǎn)）、PB303-S電子精密天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn)）和79HW-1恒溫磁力攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司生產(chǎn)）。

1.2 方法

參考GenBank中已經(jīng)公布的下列植物的RPL21基因的保守序列設計引物，包括擬南芥〔Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.〕AtL21（登錄號NM_100831）、大麥（Hordeum vulgare L.）HvL21（登錄號AK252012）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）MtL21（登錄號BT051422）、油棕（Elaeis guineensis Jacq.）EgL21（登錄號 EU284979）、毛 竹（Phyllostachys heterocycla‘Pubescens’）PeL21（登錄號FP099981）、水稻（Oryza sativa L.）OsL21（登錄號AF093630）、高粱〔Sorghum bicolor（L.）Moench〕SbL21（登錄號XM_002468489）、小麥（Triticum aestivum L.）TaL21（登錄號AF475114）以及玉米（Zea mays L.）ZmL21（登錄號EU976390）。獲得的1對 PCR引物中，上游引物序列為5′-GTTAACGGCGCCGTCCACAAG-3′；下游引物序列為5′-CATGTGCAGCCTTCAAGATGC-3′。

隨機選取保存于-75℃超低溫冰箱中的石蒜葉片全長cDNA文庫，用滅菌的LB液體培養(yǎng)基將原始菌液（OD600=1.2）依次稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6的菌液，分別取各級菌液2μL，均勻涂抹在含質(zhì)量濃度30μg·mL-1氯霉素的LB固體培養(yǎng)基上，封口膜封口后于37℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)過夜（或16 h）；隨機挑取分散均勻的單菌落，利用RPL21引物進行菌落PCR檢測。PCR反應結(jié)束后，用質(zhì)量體積分數(shù)1.2％的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，PCR產(chǎn)物上樣量為4μL。將PCR檢測為陽性的克隆交由上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，結(jié)合序列對比方法，獲得該克隆的全長cDNA序列。

PCR反應體系的總體積為10μL，包括0.5μL菌液（即模板DNA）、2.5 mmol·L-1上游和下游引物各0.5μL、10×PCR buffer（含25 mmol·L-1MgCl2）1.0 μL、2.5 mmol·L-1d NTPs0.8μL、5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2μL和6.5μL雙蒸水。PCR擴增程序為：94℃預變性5 min；然后于94℃變性30 s、55℃退火1.5 min、72℃延伸1 min，共33個循環(huán)反應；最后于72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物于-20℃冰箱中保存、備用。

1.3 序列分析

檢測并去除所測序列兩端的載體序列（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html），通過開放閱讀框?qū)ふ也⒎治鲂禄虻拈喿x框（http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html），核酸和氨基酸序列同源性采用DNAMAN軟件（Version5.2.2.9）進行分析，并用ClustalX1.8和PhyloDraw V0.82軟件進行系統(tǒng)樹分析。采用ProtParam程序（http:∥www. expasy.org/tools/protparam.html）分析石蒜RPL21的氨基酸組成，并用ProtScale程序（http:∥www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）分析石蒜RPL21的疏水性。采用Psort程序（http:∥www.psort.org）進行石蒜RPL21的亞細胞定位分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 石蒜核糖體蛋白L21基因全長cDNA序列分析

通過對篩選的陽性克隆進行測序，并刪除載體序列及引物序列。獲得的石蒜核糖體蛋白L21基因的全長cDNA序列見圖1。該序列已登錄在GenBank中，登錄號為FJ972626，命名為LrRPL21。將LrRPL21的基因序列在NCBI提供的基因庫中進行序列同源性檢索，通過BLASTn分析，確定該基因的長度為709 bp，包含53 bp的5′非編碼區(qū)、161 bp的3′非編碼區(qū)和495 bp的完整開放閱讀框，開放閱讀框的起始位點在54 bp處，終止位點在548 bp處，編碼164個氨基酸殘基。

圖1 石蒜LrRPL21基因的cDNA序列及核糖體蛋白L21的氨基酸序列Fig.1 The cDNA sequence of LrRPL21 gene and am ino acid sequence of ribosomal protein L21 of Lycoris radiata（L′Hér.）Herb.

2.2 石蒜核糖體蛋白L21的理化性質(zhì)分析

使用ProtParam程序?qū)rRPL21基因編碼的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進行預測，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)的分子量為18628，理論等電點為10.36；分子式為C833H1348N254S4，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為40.63，脂肪指數(shù)為76.59，總平均疏水性指數(shù)為-0.668。因此，判定該基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性蛋白。

2.3 石蒜LrRPL21基因編碼的氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)樹分析

將石蒜LrRPL21基因編碼的RPL21氨基酸序列與其他8種植物RPL21的氨基酸序列進行同源性比較，結(jié)果見表1。由表1可以看出：石蒜LrRPL21基因編碼的RPL21與其他8種植物RPL21的氨基酸殘基數(shù)相同，均為164；它們的氨基酸序列有較高的同源性，同源性百分率達到85％～95％。其中，石蒜LrRPL21基因編碼的 RPL21的氨基酸序列與油棕RPL21的同源性百分率最高，達到95％；與擬南芥RPL21的同源性百分率最低，但也達到85％。

表1 石蒜與其他8種植物核糖體蛋白L21氨基酸序列的同源性比較Table1 Homology comparison of am ino acid sequence of ribosomal protein L21 between Lycoris radiata（L′Hér.）Herb.and other eight species

將石蒜LrRPL21基因編碼的RPL21的氨基酸序列與油棕、毛竹、水稻、高粱、玉米、大麥、蒺藜苜蓿和擬南芥的RPL21氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析，獲得的系統(tǒng)樹見圖2。結(jié)果顯示：石蒜LrRPL21基因編碼的RPL21與油棕RPL21的進化關(guān)系最近，與擬南芥RPL21的進化關(guān)系最遠。該結(jié)果與同源性分析和經(jīng)典分類的結(jié)果基本一致。

圖2 基于核糖體蛋白L21氨基酸序列的石蒜與其他8種植物的系統(tǒng)樹Fig.2 Phylogenetic tree of Lycoris radiata（L′Hér.）Herb.and other eight species based on am ino acid sequence of ribosomal protein L21

3 討論和結(jié)論

目前，分離克隆目的基因的方法有很多，在已經(jīng)建立了高質(zhì)量全長cDNA文庫的基礎上篩選目的基因，則以采用根據(jù)保守序列設計引物并進行PCR擴增的方法最為簡單快速。本研究正是在建立了高質(zhì)量石蒜葉片全長cDNA文庫的基礎上成功克隆獲得了石蒜體內(nèi)LrRPL21基因的全長cDNA序列。

核糖體蛋白L21是構(gòu)成真核生物核糖體的80多種蛋白之一［1］。然而，許多核糖體蛋白除了組成核糖體和行使其功能以外，還具有其他重要的生理功能［5］。目前，對某些核糖體蛋白及其功能已有廣泛研究，例如L11［12］，但有關(guān)植物核糖體蛋白L21及其功能的報道比較少。作者成功克隆獲得了石蒜的LrRPL21基因，序列全長709 bp，編碼1條具有164個氨基酸殘基的多肽，預測分子量是18628，理論等電點為10.36，分子式為C833H1348N254S4，總平均疏水性指數(shù)為-0.668，屬于親水性蛋白。氨基酸序列比較結(jié)果表明：石蒜核糖體蛋白L21的氨基酸序列與其他8種植物核糖體蛋白L21的氨基酸序列的同源性百分率均較高，達到85％～95％，其中，石蒜核糖體蛋白L21與油棕L21氨基酸序列的進化關(guān)系最近。有關(guān)石蒜核糖體蛋白L21的功能有待進一步深入研究。

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