高效液相色譜法測定發(fā)芽米胚芽中的γ－氨基丁酸

張繼紅 康紹英

（湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢測所，湖南 長沙 410002）

高效液相色譜法測定發(fā)芽米胚芽中的γ－氨基丁酸

張繼紅 康紹英

（湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢測所，湖南 長沙 410002）

建立一種高靈敏度的鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生熒光檢測高效液相色譜法測定發(fā)芽米胚芽中γ－氨基丁酸（GABA）含量的方法。色譜柱為Shimadzu VP－ODS C18柱（250mm ×4.6mm，5μm），流動相：0.05mol／L 乙酸鈉∶甲醇＝60∶40，熒光發(fā)射波長λex 338nm，激發(fā)波長λem 430nm。 方法的線性范圍為0.10～1.0μg／mL，檢出限為0.005μg／mL。日間和日內(nèi)測定的精密度分別為1.36%和2.54%，加標(biāo)回收率在98.5%～99.8%。該法簡便、快速、靈敏度高，可用于發(fā)芽米胚芽中GABA的質(zhì)量控制。

鄰苯二甲醛；柱前衍生；高效液相色譜法；γ－氨基丁酸

γ－氨基丁酸（GABA）是一種非蛋白質(zhì)類氨基酸，在醫(yī)學(xué)上是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠促進(jìn)大腦新陳代謝，對機(jī)體正常生理功能起著重要的調(diào)節(jié)作用。由于它對電化學(xué)和紫外、可見光的不靈敏性，導(dǎo)致用一些常規(guī)的直接測定法靈敏度較低，中國對其檢測方法的報道很少，偶見有用柱前衍生反相高效液相色譜法［1－3］和全自動氨基酸分析儀檢測［4］方法的報道。常用的衍生方法有DNS法（衍生劑為丹酰氯），F(xiàn)MOC法（衍生劑為氯甲酸芴甲酯），PITC法（衍生劑為異硫氰酸苯酯），CEOC法（衍生劑為咔唑－9－乙基氯甲酸酯）和OPA法（衍生劑為鄰苯二甲醛）等。前4種方法存在反應(yīng)活性差、速度慢、靈敏度低、反應(yīng)試劑干擾等缺點，而柱前衍生試劑OPA具有衍生步驟簡單、反應(yīng)速度快、剩余試劑不干擾測定等優(yōu)點，其應(yīng)用最為廣泛。本試驗采用OPA為衍生試劑，測定發(fā)芽米胚芽中的γ－氨基丁酸的含量，優(yōu)化分離條件。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（RF－10Axl熒光檢測器）：SPD－M20A，日本Shimadzu公司；

水浴恒溫振蕩器：SHZ－A，上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠；

分析天平：BT224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 試劑

γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%，美國Sigma公司；

甲醇：色譜純，國藥化學(xué)試劑有限公司；

鄰苯二甲醛（OPA）、2－巰基乙醇（2－MCE）：優(yōu)級純，國藥化學(xué)試劑有限公司；

四硼酸鉀、三水合乙酸鈉、三氯乙酸：分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.3 色譜條件

色譜柱：Shimadzu VP－ODS C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.05mol／L乙酸鈉∶甲醇＝60∶40；流速為1mL／min；柱溫35℃；熒光檢測器：發(fā)射波長338nm，激發(fā)波長430nm；進(jìn)樣量20μL。

1.4 流動相和衍生試劑的配制

1.4.1 流動相 稱取6.804 0g三水合乙酸鈉，用二次蒸餾水定容到1 000mL，再用0.45μm濾膜過濾，然后用超聲波清洗器超聲脫氣20min備用。

1.4.2 OPA衍生試劑的配制 500mg OPA溶于10mL甲醇，用0.4mol／L四硼酸鉀溶液（氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10）稀釋到100mL，加400μL 2－MCE搖勻，于4℃冰箱中保存（可使用2d）。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液及發(fā)芽米胚芽樣品衍生處理

準(zhǔn)確稱量γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)樣品10mg于100mL容量瓶中，超純水定容，得100μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，然后稀釋100倍得到1μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

稱取0.1g左右發(fā)芽米胚芽樣品于100mL容量瓶中，加入7mL 8%的三氯乙酸，在40℃水浴中振蕩2h，冷卻后定容搖勻并靜置，離心取上清液備用，得到發(fā)芽米胚芽樣液。

取樣液或標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1mL，加入OPA衍生試劑1mL，混勻衍生反應(yīng)2min后過0.45μm濾膜至樣品瓶中，立即進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)芽米胚芽樣品的分離

在1.3色譜條件下，在Shimadzu VP－ODS C18柱上對衍生的標(biāo)樣和實際發(fā)芽米胚芽樣品組分進(jìn)行了有效的分離。γ－氨基丁酸的保留時間為18.654min，發(fā)芽米胚芽樣品中的γ－氨基丁酸的保留時間為18.983min，實際發(fā)芽米胚芽樣品中其它共存氨基酸和雜質(zhì)不干擾目標(biāo)物的測定。標(biāo)準(zhǔn)品及發(fā)芽米胚芽樣品的色譜圖見圖1和圖2。

圖1 γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Figure 1 Chromatogram ofγ－aminobutyric acid standard

圖2 發(fā)芽米胚芽樣品的色譜圖Figure 2 Chromatogram of germinated rice germ sample

2.2 衍生反應(yīng)時間的選擇

γ－氨基丁酸與OPA試劑反應(yīng)的程度直接與衍生反應(yīng)的時間相關(guān)。時間過短會使衍生反應(yīng)不徹底，過長又會使衍生產(chǎn)物迅速被破壞，直接影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。因此，準(zhǔn)確控制衍生反應(yīng)時間是整個測定的關(guān)鍵。試驗過程中，衍生反應(yīng)在室溫下30s內(nèi)即可發(fā)生，隨著反應(yīng)時間的增加，衍生產(chǎn)物的峰面積增加，在2min時峰面積最大，之后隨反應(yīng)時間的延長，衍生產(chǎn)物反而會分解，故衍生反應(yīng)時間以2min為宜［5］。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由于熒光檢測的靈敏度很高，用濃度比較低的γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液做校正曲線和定量檢測。取γ－氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，配成濃度為0.10，0.20，0.50，0.80，1.0μg／mL的試液，精密移取供試液1mL，加入1mL OPA衍生試劑，混勻，衍生反應(yīng)2min后過0.45μm濾膜至樣品瓶中，立即進(jìn)樣分析。以峰面積為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物相應(yīng)的濃度為橫坐標(biāo)做校正曲線，并進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明在所測濃度范圍內(nèi)γ－氨基丁酸呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

2.4 回收率試驗

向已知濃度的發(fā)芽米胚芽試樣中分別添加低、中、高3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，即添加量分別為10，20，40μg，重復(fù)樣品的衍生處理后進(jìn)樣分析測定，扣除樣品中原有的含量，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗Table 1 The recovery test（ n＝3）

2.5 精密度試驗

方法的精密度是通過5次連續(xù)進(jìn)樣來評價的，日內(nèi)、日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.36%和2.54%（n＝5）。

2.6 樣品測定

按前述色譜方法和樣品衍生處理對8種發(fā)芽米胚芽中的γ－氨基丁酸的含量進(jìn)行了測定，測定結(jié)果分別為0.56，1.42，0.77，0.34，0.63，0.16，0.21，0.25mg／g。

3 結(jié)論

本試驗應(yīng)用鄰苯二甲醛柱前衍生反相高效液相色譜法檢測發(fā)芽米胚芽中的γ－氨基丁酸的含量，該方法操作簡單，衍生反應(yīng)快、靈敏度高，易于推廣使用，可作為發(fā)芽米胚芽中的γ－氨基丁酸的含量測定的一種優(yōu)選方法。

1 劉惠文.高效液相色譜法測定南瓜粉中的4－氨基丁酸 ［J］.色譜，2001，19（6）：532～533.

2 張暉，吳勝芳，姚惠源.OPA柱前自動衍生－紫外檢測米胚芽中的γ－氨基丁酸的 HPLC法研究 ［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29（10）：50～52.

3 明永飛，尤進(jìn)茂，傅曉云，等.高效液相色譜熒光檢測法測定瓜子中的4－氨基丁酸 ［J］.分析化學(xué)，2005，33（3）：432.

4 張華，王靜，徐德昌，等.發(fā)芽糙米功能因子γ－氨基丁酸的測定［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，26（5）：25～27.

5 陳稚.食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑及保健食品中的違禁藥物分析方法研究［D］.長沙：湖南師范大學(xué)，2006.

Determination ofγ－aminobutyric acid in germinated rice germ by high performance liquid chromatography

ZHANG Ji－h(huán)ong KANG Shao－ying

（The Institute of Food Quality Supervision and Test in Hunan Province，Changsha，Hunan410002，China）

A new highly sensitive high performance liquid chromatography（HPLC）with fluorescence detection method for determination γ－aminobutyric acid（GABA）in germinated rice germ was developed by precolumn derivatization of GABA with ortho－phthalaldehyde（OPA）.GABA was determined on Shimadzu VP－ODS C18column（250mm×4.6mm，5μm）with mobile phase of acetate sodium（0.05mol／L）and methanol（60∶40），with detection wavelengthλex＝338nm，λem＝430nm.The linear range of the method was 0.10～1.0μg／mL.The lower limit of detection was 0.005μg／mL.The inter－and intra－assav precisions were 1.36%and 2.54%respectively.The recoveries were between 98.5%and 99.8%.The method is easy，rapid，sensitive，and accurate，can be used as a standard GABA quality control of the germinated rice germ.

ortho－phthalaldehyde（OPA）；pre－column derivatization；high performance liquid chromatography；γ－aminobutyric acid

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.022

張繼紅（1967－），女，湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢測所高級工程師。E－mail：jihongzhang1967＠163.com

2011－04－10