轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性基團研究

馬永強 岳文靜 張 娜 張毅方 錢 鐳劉 穎

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈高科大豆食品有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150078）

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性基團研究

馬永強1岳文靜1張 娜1張毅方2錢 鐳1劉 穎1

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)黑龍江省普通高等學(xué)校食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈高科大豆食品有限責(zé)任公司，黑龍江 哈爾濱 150078）

采用 PMSF、NBS、IAc、BrAc、SUAN、NEM、DTT、Na2SO3、EDC、WRK 10種化學(xué)修飾劑在一定的條件下選擇性修飾轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，研究轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶分子中氨基酸側(cè)鏈基團與酶活性中心的關(guān)系。結(jié)果表明：PMSF、NBS、IAc、BrAc、SUAN、NEM等化學(xué)修飾劑能顯著抑制酶活力，而DTT、Na2SO3、EDC、WRK對酶活影響不大，說明絲氨酸殘基、色氨酸殘基、組氨酸殘基、賴氨酸殘基、半胱氨酸殘基對酶活力影響很大，位于酶的活性中心，二硫鍵、谷氨酸（天冬氨酸）殘基對酶活幾乎沒有影響，不位于酶的活性中心。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶；化學(xué)修飾；活性中心

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG；EC2.3.2.13；全稱為蛋白質(zhì)－谷氨酰胺γ－谷氨酰胺基轉(zhuǎn)移酶）是一種能催化轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，催化蛋白質(zhì)中賴氨酸上的ε－氨基和谷氨酸上的γ－羥酰胺基之間的結(jié)合反應(yīng)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)（或多肽）之間發(fā)生共價交聯(lián)形成共價化合物的聚合酶［1］。它可通過胺的導(dǎo)入、交聯(lián)以及脫胺3種途徑改性蛋白質(zhì)，不僅可以通過引入賴氨酸等氨基酸而提高蛋白質(zhì)的營養(yǎng)效價，還能改善食品的功能特性，延長貨價期以及減少食品中的過敏源［2－4］。

酶的小分子修飾是用小分子修飾劑共價修飾酶，使酶的穩(wěn)定性提高。利用小分子化合物對酶的活性部位及活性部位外的側(cè)鏈基團進行化學(xué)修飾，以改變酶的一些性質(zhì)［5］。修飾劑主要修飾酶表面的以下基團：－COO－、－NH3＋、－SH、－OH、咪唑基等。蛋白質(zhì)化學(xué)修飾是研究酶的活性中心，探明酶必需基團組成的一個有效辦法，利用這一方法迄今已獲得了大量有關(guān)酶的結(jié)構(gòu)與功能的信息，在一定條件下采用特定氨基酸修飾劑對酶的氨基酸側(cè)鏈基團進行修飾可確定其活性功能集團，并且修飾過的酶穩(wěn)定性優(yōu)于原酶［6－8］。雖然這一修飾方法已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，但是對于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的小分子修飾，目前國內(nèi)外都未對其進行研究。本試驗采用小分子修飾的方法對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行修飾，從而確定其活性基團。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶：江蘇泰興一鳴精細(xì)化工有限公司。

1.2 試劑

苯甲基磺酰氟（PMSF），溴乙酸（BrAc），碘乙酸（Iac），N－乙基馬來酰亞胺（NEM），Woodward s reagent K（WRK）：分析純，上海晶純試劑有限公司；

N－溴代琥珀酰亞胺（NBS）：分析純，上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)五聯(lián)化工廠；

琥珀酸酐（SUAN）：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

二硫蘇糖醇（DTT）：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

亞硫酸鈉：分析純，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；

碳化二亞胺（EDC）：分析純，上海晶純試劑有限公司。

1.3 主要儀器

紫外可見分光光度計：Spectrum722E型，上海光譜儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：SY－2－4，天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 酶活測定方法 采用Folk等報道的分光Hydroxamate分析法［9］測定。試劑 A：含0.1mol／L Tris－HCl緩沖液（pH＝6.0），0.1mol／L羥胺，0.01mol／L還原型谷胱甘肽及0.03mol／L N－α－CBZ－Gln－Gly的混合液；試劑 B：3mol／L HCl，12%三氯乙酸及5%FeCl3·6H2O（溶解于0.1mol／L HCl中）等體積混合。試劑A在37℃與酶液反應(yīng)10min后，添加試劑B終止酶反應(yīng)并形成紅色鐵化合物，在4 000r／min的轉(zhuǎn)速下離心15min除去沉淀，上清液于525nm測定吸光度，用L－谷氨酸γ－單羥肟酸（L－Glutamic acidγ－monohydroxamic acid）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。1單位轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活力單位定義為：37℃每分鐘產(chǎn)生1μmol L－谷氨酸γ－單羥肟酸所需酶量（U／mL）。

相對酶活：以相同條件下所測定的最高酶活力定義為100，其余與之相比所得的數(shù)為相對酶活。

1.4.2 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最適pH值研究 吸取1mL酶液，加入到具塞試管中，再加入2mL pH值為2～10的A試劑，于37℃水浴反應(yīng)10min，取出立即加入2mL B試劑終止酶反應(yīng)。于525nm波長測定其吸光值，平行測定3次，取其平均值，計算其酶活力。以溫度為橫坐標(biāo)，相對酶活為縱坐標(biāo)作圖，得出轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的最適pH值。

1.4.3 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的小分子修飾 將PMSF、NBS、IAc、BrAc、SUAN、NEM、DTT、Na2SO3、EDC和 WRK 10種修飾劑的母液稀釋成一定梯度濃度，與酶液作用［10－12］，在正常條件下測定轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的剩余酶活。以緩沖溶液代替抑制劑溶液測得的酶活力為100%。以剩余活性的百分比為縱坐標(biāo)，以修飾劑濃度為橫坐標(biāo)作圖，分析修飾劑對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活性的影響。試驗重復(fù)3次，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最適pH值

由圖1可知，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最適pH值為6.0～7.0，這與Ando等［13］報道的從Streproverticillim－8112中分離到的MTGase的最適pH（pH 6.0～7.0）相一致。

2.2 酶的側(cè)鏈基團修飾

2.2.1 PMSF對絲氨酸的修飾 苯甲基磺酰氟（PMSF）是蛋白質(zhì)絲氨酸殘基的有效修飾劑。本試驗用不同濃度PMSF與酶發(fā)生作用，發(fā)現(xiàn)酶的活力隨著修飾劑濃度的增大而下降。如圖2所示，當(dāng)PMSF濃度為0.9mmol／L時，酶活力已接近零，由此證明PMSF對酶活影響非常大。

圖1 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最適pH值的研究Figure 1 The research of transglutaminase optimal pH value

圖2 PMSF對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響Figure 2 Effect of PMSF to transglutaminase activity

2.2.2 NBS對色氨酸的修飾 N－溴代琥珀酰亞胺（NBS）在酸性條件下，可以選擇性地氧化色氨酸側(cè)鏈吲哚為氧化吲哚。因此，本試驗在酸性條件下，用不同濃度的NBS與酶發(fā)生反應(yīng)。如圖3所示，當(dāng)NBS濃度增大為1mmol／L時，酶的相對活已不足5%，由此證明NBS對酶活的影響非常大。

圖3 NBS對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響Figure 3 Effect of NBS to transglutaminase activity

2.2.3 BrAc和IAc對組氨酸的修飾 在偏酸性條件下，BrAc（溴乙酸）和IAc（碘乙酸）可特異修飾蛋白質(zhì)分子中的組氨酸殘基。本試驗中，用不同濃度的BrAc和IAc在pH為5.0的醋酸緩沖溶液中與酶作用，如圖4所示，當(dāng)BrAc和IAc濃度為100mmol／L時，相對酶活已不足5%，由此證明BrAc和IAc對酶活的影響非常大。

2.2.4 SUAN對賴氨酸的修飾 SUAN是作用于酶分子氨基的有效試劑，能夠與賴氨酸殘基的ε－氨基發(fā)生反應(yīng)，使酶被修飾。本試驗中，用不同濃度的SUAN與酶作用，如圖5所示，當(dāng)SUAN濃度為1.2mmol／L時，相對酶活已降至5%左右，由此證明SUAN對酶活的影響非常大。

2.2.5 NEM對巰基的修飾 N－乙基馬來酰亞胺（NEM）是一種特效巰基修飾劑，可專一地與巰基反應(yīng)，是目前用于修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈巰基的常用試劑。本試驗中，用不同濃度的NEM與酶作用，探討NEM濃度與酶活力的關(guān)系。如圖6所示，當(dāng)NEM濃度為18mmol／L時，相對酶活已降至5%左右，當(dāng)NEM濃度增大為20mmol／L時，相對酶活已接近零。說明NEM對酶活的影響非常大。

圖4 BrAc、IAc對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響Figure 4 Effect of BrAc and IAc to transglutaminase activity

圖5 SUAN對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響Figure 5 Effect of SUAN to transglutaminase activity

圖6 NEM對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響Figure 6 Effect of NEM to transglutaminase activity

2.2.6 DTT對二硫鍵的修飾 二硫蘇糖醇（DTT）有很強的還原性，可以使酶分子中的二硫鍵斷裂，如果酶的活性中心存在二硫鍵，酶活力將明顯降低。本試驗中，DTT并沒有使酶活有明顯的變化，當(dāng)DTT濃度達到1mmol／L時，酶活力仍然保持在84%。本試驗采用Na2SO3斷裂二硫鍵進行了驗證，結(jié)果見圖7，當(dāng)Na2SO3濃度達到1mmol／L時，酶活力仍然保持在80%以上。說明這兩種二硫鍵修飾劑對酶活幾乎沒有影響。

2.2.7 EDC對谷氨酸（天冬氨酸）的修飾 EDC（碳化二亞胺）和 WRK（Woodward s reagent K）可專一性的作用于谷氨酸（天冬氨酸）羧基，常作為谷氨酸（天冬氨酸）專用修飾劑。本試驗中采用不同濃度EDC和WRK分別作用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，結(jié)果見圖8。由圖8可知，當(dāng)修飾劑濃度達100mmol／L時，酶活力仍然沒有明顯的下降，說明EDC和WRK對酶活力幾乎沒有影響。

圖7 DTT、亞硫酸鈉對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響Figure 7 Effect of DTT and Na2SO3to transglutaminase activity

圖8 EDC、WRK對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶活的影響Figure 8 Effect of EDC and WRK to transglutaminase activity

3 結(jié)論

在一定反應(yīng)條件下，PMSF、NBS、IAc、BrAc、NEM 對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶修飾后，酶活力大大降低，可假設(shè)絲氨酸、色氨酸、組氨酸、半胱氨酸殘基為轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶活性中心的必需基團。而這一假設(shè)正與Kinya等［14］提出的無論是不需要Ca2＋激活的TGase還是需要Ca2＋激活的TGase活性中心氨基酸序列均含有絲氨酸、色氨酸、組氨酸、半胱氨酸的說法相一致，因此，可證明絲氨酸殘基、色氨酸殘基、組氨酸殘基、半胱氨酸殘基位于該酶活性中心。而DTT、Na2SO3、EDC、WRK修飾后，酶活力并無明顯影響，說明二硫鍵和谷氨酸（天冬氨酸）殘基不位于該酶活性中心。

對轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶最適pH值研究中得出該酶最適pH值為6.0～7.0，說明該酶帶有正電荷，而在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶氨基酸構(gòu)成中只有賴氨酸殘基ε－氨基是帶有正電荷，所以該結(jié)論也可支持前文（2.2.4）SUAN對賴氨酸的修飾結(jié)果，證明賴氨酸殘基也位于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的活性中心。

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Determination of transglutaminase activity groups

MA Yong－qiang1YUE Wen－jing1ZHANG Na1ZHANG Yi－fang2QIAN Lei1LIU Ying1

（1.Key Laboratory of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin，Heilongjiang150076，China；2.Harbin Hi－Tech Soybean Food Co.Ltd.，Harbin，Heilongjiang150078，China）

The transglutaminase were selectively modified by ten chemical reagents such as PMSF，NBS，IAc，BrAc，SUAN，NEM，DTT，Na2SO3，EDC，WRK，respectively.It can be found that the enzyme activity was decreased significantly after modification of PMSF，NBS，IAc，BrAc，SUAN，NEM，but oppositely the DTT，Na2SO3，EDC and WRK didn t obviously affect the transglutaminase enzyme activity.Study of the chemical modification demonstrated that the Serine residues，Tryptophan residues，Histidine residues，Lysine residues and Cysteinyl residues were essential functional groups inside of the transglutaminase active site，at the same time suggested disulfide bond and Glutamate（Aspartate）residues didn t significantly affect the enzyme activity and are not located in the enzyme active site.

transglutaminase；chemical modification；active site

10.3969／j.issn.1003－5788.2011.04.002

國家“863”計劃項目（編號：2008AA10Z303）

馬永強（1963－），男，哈爾濱商業(yè)大學(xué)教授，碩士。E－mail：mayq＠hrbcu.edu.cn

2011－03－15