雙水相萃取法富集分離地木耳中的藻藍(lán)蛋白

甘林火

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 泉州 362021）

雙水相萃取法富集分離地木耳中的藻藍(lán)蛋白

甘林火

（華僑大學(xué) 化工學(xué)院，福建 泉州 362021）

采用聚乙二醇（PEG 4000）／硫酸鹽雙水相體系，經(jīng)一次萃取從地木耳細(xì)胞破碎液中富集分離藻藍(lán)蛋白.分別考察萃取時(shí)間、硫酸鹽種類及濃度、PEG 4000濃度、溶液pH值和離子強(qiáng)度對(duì)雙水相萃取分離地木耳中藻藍(lán)蛋白的影響.結(jié)果表明：在萃取時(shí)間為30min，Na2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，PEG 4000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，加入KCl的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，pH值為3.0的最優(yōu)條件下，藻藍(lán)蛋白萃取率可達(dá)95.2%，純度為4.8.

地木耳；藻藍(lán)蛋白；聚乙二醇；雙水相體系；萃取

藻藍(lán)蛋白（PC）是從藻類中分離出的一種深藍(lán)色物質(zhì).它既是一種蛋白質(zhì)，又是一種極好的天然食用色素，同時(shí)還是良好的保健食品，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值［1］.傳統(tǒng)的從藍(lán)藻中提取分離藻藍(lán)蛋白的方法多采用鹽析沉淀法［2-3］，包括沉淀、離心和透析3個(gè)主要操作環(huán)節(jié)，這在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中存在操作步驟繁瑣、動(dòng)力能耗高及操作周期長等缺點(diǎn).Albertsson［4］于20世紀(jì)50年代后期開發(fā)了雙水相萃取法.70年代以后，雙水相萃取技術(shù)在生物分離過程中得到廣泛應(yīng)用［5］，為蛋白質(zhì)特別是胞內(nèi)蛋白質(zhì)的分離與純化開辟了新的途徑，具有良好的發(fā)展前景.劉楊等［6］研究了雙水相萃取法從螺旋藻中分離提取藻藍(lán)蛋白，萃取效率和分配系數(shù)均較高.地木耳（Nostoc）學(xué)名普通念珠藻，是陸生藍(lán)藻中的一種，其蛋白含量高達(dá)20%，且藻藍(lán)蛋白豐富［7］.本文采用聚乙二醇（PEG 4000）／硫酸鹽雙水相體系，分離提取地木耳中的藻藍(lán)蛋白.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地木耳粉為自制（采自福建泉州華僑大學(xué)），聚乙二醇（PEG 4000，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），Na2SO4（廣東廣州化學(xué)試劑分公司），（NH4）2SO4（廣東汕頭西隴化工廠），其余試劑均為分析純.

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（浙江寧波新芝生物科技有限公司），高速低溫離心機(jī)（德國赫姆勒實(shí)驗(yàn)室儀器），電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），四聯(lián)磁力攪拌器（江蘇金壇江南儀器廠），紫外可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 地木耳細(xì)胞破碎 稱取2g地木耳粉于100mL的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH＝7）中，在超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中破碎（冰浴條件下，全程時(shí)間20min，工作間歇時(shí)間9s，超聲時(shí)間6s，溫度保護(hù)30℃）.將破碎后的地木耳細(xì)胞懸濁液于10 000r·min－1，4℃的冷凍離心機(jī)中離心20min后取出抽濾，加入磷酸鹽緩沖液定容至400mL，所得清液即為含有藻藍(lán)蛋白的粗提液，測定其中的藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度.

1.2.2 雙水相萃取實(shí)驗(yàn) 量取20mL粗提液于具塞錐形瓶中，加入定量PEG 4000和硫酸鹽，常溫下在磁力攪拌器上攪拌一定時(shí)間，取出溶液于分液漏斗中靜置、分層，將上相溶液移至10mL刻度試管中，測上相體積；同時(shí)采用可見分光光度法測定上下相溶液中藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度.

1.2.3 藻藍(lán)蛋白的測定與計(jì)算 藻藍(lán)蛋白最大光吸收在620nm附近，因此藻藍(lán)蛋白質(zhì)量濃度可根據(jù)Kaplan等［8］采用的方法進(jìn)行測定，即

式（1）中：ρ（PC）為藻藍(lán)蛋白的質(zhì)量濃度（g·L－1）；D（620），D（650）分別為波長在620，650nm處的光密度值.

藻藍(lán)蛋白萃取率（η）和分配系數(shù)（K）的計(jì)算公式為

式（2），（3）中：V 為溶液體積（mL）；下標(biāo)0，t，b分別代表藻藍(lán)蛋白破碎，萃取后雙水相體系上相和下相.

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取時(shí)間對(duì)萃取PC的影響

量取20mL粗提液于具塞錐形瓶中，分別配制12%的PEG 4000和15%的Na2SO4，與PEG 4000形成雙水相體系［9］.常溫下在磁力攪拌器上攪拌，考察萃取時(shí)間對(duì)雙水相萃取法富集分離地木耳中藻藍(lán)蛋白的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)萃取時(shí)間分別為10，20，30，40min時(shí)，萃取率分別為29.5%，48.3%，79.1%和76.96%.由此可知，隨著萃取時(shí)間的增長，藻藍(lán)蛋白萃取率先逐漸增大，在30min后趨于穩(wěn)定.表明，30min時(shí)雙水相萃取達(dá)到平衡，故萃取時(shí)間選為30min.

2.2 硫酸鹽種類對(duì)萃取PC的影響

分別配制12%的PEG 4000和15%的Na2SO4雙水相體系，12%的PEG 4000和15%的（NH4）2SO4雙水相體系 .常溫下攪拌30min，考察雙水相體系中不同硫酸鹽對(duì)雙水相萃取法富集分離地木耳中藻藍(lán)蛋白的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)雙水相組分為Na2SO4時(shí)，萃取率為80.49%，分配系數(shù)為4.580 3%；當(dāng)雙水相組分為（NH4）2SO4時(shí)，萃取率為74.54%，分配系數(shù)為2.184 2%.由此可見，無論是藻藍(lán)蛋白的萃取率還是分配系數(shù)，含Na2SO4的雙水相體系都要高于含（NH4）2SO4的雙水相體系.綜上所述，實(shí)驗(yàn)采用PEG 4000／Na2SO4雙水相體系來富集提取地木耳中藻藍(lán)蛋白.

2.3 PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取PC的影響

分別配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG 4000和15%的Na2SO4雙水相體系，常溫下攪拌30min，考察PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w（PEG 4000））對(duì)分離藻藍(lán)蛋白的影響，結(jié)果如表1所示.從表1可以看出，隨著PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，藻藍(lán)蛋白的萃取率呈現(xiàn)逐漸增大的趨勢(shì)，而藻藍(lán)蛋白的分配系數(shù)則是先增大后減小.

聚合物濃度是影響雙水相萃取的重要因素之一.隨著PEG 4000濃度的增大，雙水相體系離成相臨界點(diǎn)的距離增大，系線長度增加，兩相性質(zhì)的差別（疏水性等）增大，界面張力也隨之增大，水溶性的藻藍(lán)蛋白越容易分配到一相中去 .因此，藻藍(lán)蛋白的萃取率在不斷提高.但是，上相體積也在逐漸增大，分配系數(shù)就不是單調(diào)變化的.結(jié)合η和K 值進(jìn)行綜合分析，實(shí)驗(yàn)選取PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的雙水相體系.

表1 PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取PC的影響Tab.1 Effect of mass fraction of PEG 4000on extraction of PC

2.4 Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取PC的影響

分別配制不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Na2SO4和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的PEG 4000雙水相體系，常溫下攪拌30 min.考察Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w（Na2SO4））對(duì)集分離藻藍(lán)蛋白的影響，結(jié)果如圖1所示.從圖1可見，隨著Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，藻藍(lán)蛋白的收率呈先增大后減小的趨勢(shì)，但總體變化不顯著.在PEG／Na2SO4雙水相體系中，Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)選取15%.

2.5 離子強(qiáng)度對(duì)萃取PC的影響

2.5.1 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取PC的影響 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的PEG 4000和15%的Na2SO4雙水相體系，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl于溶液中，常溫下攪拌30min.考察NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w（NaCl））對(duì)分離藻藍(lán)蛋白的影響，結(jié)果如圖2所示.從圖2可知，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大時(shí)，在實(shí)驗(yàn)選取的范圍內(nèi)，藻藍(lán)蛋白的萃取率有所降低且降幅較小，最大降幅在10%左右.

圖1 Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取PC的影響Fig.1 Effect of mass fraction of Na2SO4 on the extraction of PC

圖2 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取PC的影響Fig.2 Effect of mass fraction of NaCl on extraction of PC

2.5.2 KCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取PC的影響 配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的PEG 4000和15%的Na2SO4雙水相體系，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的KCl于溶液中，常溫下攪拌30min.考察KCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)（w（KCl））對(duì)分離藻藍(lán)蛋白的影響，結(jié)果如圖3所示.從圖3可知，當(dāng)KCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大時(shí)，在實(shí)驗(yàn)選取的范圍內(nèi)，藻藍(lán)蛋白的萃取率先增大后趨于穩(wěn)定.

比較加入NaCl，KCl對(duì)PEG／Na2SO4雙水相體系萃取分離地木耳中藻藍(lán)蛋白過程的影響，出現(xiàn)了2種不同的結(jié)果.由于實(shí)驗(yàn)采用的緩沖溶液是由Na2HPO4和NaH2PO4配制而成的，加入NaCl后，Na＋對(duì)含緩沖溶液的粗提液有鹽析的作用，而使藻藍(lán)蛋白的萃取率有所降低；而加入KCl后，K＋對(duì)含緩沖溶液的粗提液有鹽溶的作用，而使藻藍(lán)蛋白的萃取率先增大后趨于穩(wěn)定.

2.6 pH值對(duì)萃取PC的影響

選用pH值為3～8的粗提液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察pH值對(duì)雙水相萃取法富集分離地木耳藻藍(lán)蛋白的影響，結(jié)果如圖4所示.從圖4可知，在pH值為3～5時(shí)，藻藍(lán)蛋白的收率逐漸降低；在pH值為5～8時(shí)，藻藍(lán)蛋白的萃取率逐漸增大；當(dāng)pH值為5時(shí)，萃取率出現(xiàn)最小值.

圖3 KCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取PC的影響Fig.3 Effect of mass fraction of KCl on extraction of PC

圖4 pH值對(duì)萃取PC的影響 Fig.4 Effect of pH value on extraction of PC

在雙水相體系中，pH值是影響雙水相萃取的重要因素之一.由于蛋白質(zhì)在溶液中有兩性電離現(xiàn)象.當(dāng)pH＝pI（等電點(diǎn)）時(shí)，該蛋白質(zhì)極性基團(tuán)解離的正負(fù)離子數(shù)相等，凈電荷為零.在某一pH值的溶液中，當(dāng)pH＞pI時(shí)該蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷；反之，pH＜pI時(shí)該蛋白質(zhì)帶正電荷.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈電荷為零，顆粒無電荷間的排斥作用，易凝集成大顆粒，因而最不穩(wěn)定，溶解度最小，易沉淀析出.藻藍(lán)蛋白的pI值在4～5之間［10］，因此，在pH＝5左右時(shí)藻藍(lán)蛋白溶解度減小，最終導(dǎo)致藻藍(lán)蛋白萃取率降低，出現(xiàn)最小值.

2.7 最優(yōu)工藝條件的藻藍(lán)蛋白純度

藻藍(lán)蛋白的純度一般采用紫外可見分光光度法測定，以D（620）與D（280）的比值來表示 .綜上所述，在萃取時(shí)間為30min，PEG 4000質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，Na2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，加入KCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，pH值為3.0的最優(yōu)工藝條件下，利用PEG 4000和Na2SO4雙水相體系對(duì)地木耳中藻藍(lán)蛋白進(jìn)行富集分離，其萃取率為95.2%.采用該法測定富集相中藻藍(lán)蛋白的純度，結(jié)果可達(dá)4.8，達(dá)到了普遍認(rèn)可的商業(yè)化標(biāo)準(zhǔn).

3 結(jié)束語

采用PEG／Na2SO4雙水相體系萃取分離地木耳中藻藍(lán)蛋白，具有含水量高，不會(huì)引起生物活性物質(zhì)失活或變性［11］，易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純工序可直接相連接而無需進(jìn)行特殊處理，不存在有機(jī)溶劑殘留問題，對(duì)人體無害等突出的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有分離和濃縮的效果.由此可見，工藝具有良好的工業(yè)開發(fā)前景.

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Aqueous Two－Phase Extraction for Enrichment and Separation of Phycocyanin from Nostoc

GAN Lin－h(huán)uo
（College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China）

Enrichment and separation of phycocyanin from nostoc cell homogenates was studied under polyethylene glycol（PEG 4000）／sulphate aqueous two－phase system by one step extraction.The effects of time，type and concentration of sulphate，the concentration of PEG 4000，ionic strength and pH value on the extraction behavior were investigated respectively.The optimized extraction rate of phycocyanin from nostoc was 95.2%and reached the purity of 4.8，and the optimum conditions for extraction were extraction time of 30min，Na2SO4mass fraction of 15%，PEG 4000mass fraction of 12%，KCl mass fraction of 1%with pH value of 3.0.

nostoc；phycocyanin；polyethylene glycol；aqueous two－phase system；extraction

黃曉楠 英文審校：劉源崗）

TQ 936.2；TQ 028.3＋2

A

1000－5013（2011）06－0672－04

2010－11－18

甘林火（1979－），女，講師，主要從事天然產(chǎn)物和氨基酸的分離提取及制備的研究.E－mail：lhgan＠hqu.edu.cn.

華僑大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（08X0211＊）