白介素1β對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元鈉電流的急性作用

齊 翠, 張偉偉, 王 飛, 鮑朝飛, 王歆瑋, 李霄楠, 余曉青, 周 辰,

(1. 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002; 2. 河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河北 保定 071000)

白介素1β對(duì)大鼠皮層神經(jīng)元鈉電流的急性作用

齊 翠1, 張偉偉2, 王 飛1, 鮑朝飛1, 王歆瑋1, 李霄楠1, 余曉青1, 周 辰1,*

(1. 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002; 2. 河北大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 河北 保定 071000)

白介素1β(Interleukin-1β, IL-1β)是重要的促炎細(xì)胞因子, 在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和疾病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。電壓門控的鈉通道是神經(jīng)元中最重要的離子通道之一, 是產(chǎn)生再生性動(dòng)作電位的基礎(chǔ), 決定了神經(jīng)元的興奮性等電學(xué)性質(zhì), 也與多種中樞疾病過程相關(guān)。然而, 現(xiàn)在還沒有直接關(guān)于IL-1β與中樞鈉通道的相互關(guān)系的研究。在該研究中, 使用全細(xì)胞膜片鉗記錄測(cè)定了IL-1β對(duì)培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元鈉電流的急性作用, 并分析了由此對(duì)動(dòng)作電位的影響。結(jié)果顯示, IL-1β對(duì)鈉電流幅度只有較小的抑制, 而顯著降低鈉通道的半激活電壓, 不改變激活的斜率因子和失活性質(zhì), 這個(gè)作用引起動(dòng)作電位閾值顯著降低。這些結(jié)果提示在損傷和疾病過程中, 快速釋放的IL-1β可能會(huì)增加神經(jīng)元興奮性, 從而惡化神經(jīng)損傷過程。

白介素1β; 皮層神經(jīng)元; 電壓依賴性鈉電流; 膜片鉗記錄

促炎細(xì)胞因子白介素 1β(IL-1β)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用, 參與多種生理學(xué)和病理生理學(xué)過程, 包括興奮毒性 (Fogal & Hewett, 2008) 和癲癇 (Rijkers et al, 2009) 等。最近越來越多的研究關(guān)注 IL-1β對(duì)神經(jīng)元離子通道的作用, 包括中樞與外周神經(jīng)系統(tǒng), 如小直徑三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中的鉀通道 (Takeda et al, 2008)、海馬神經(jīng)元中的鈣激活鉀通道 (Zhang et al, 2008) 以及培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元中的鈣通道 (Zhou et al, 2006a, b)。電壓門控的鈉通道是最重要的離子通道類型之一, 在可興奮細(xì)胞中,鈉通道激活產(chǎn)生的再生性事件是動(dòng)作電位產(chǎn)生的基礎(chǔ), 并且可以決定興奮性。成纖維細(xì)胞生長因子同源因子敲除的小鼠中, 鈉通道的電生理學(xué)性質(zhì)發(fā)生改變。因此, 小腦顆粒神經(jīng)元不能反復(fù)產(chǎn)生動(dòng)作電位 (Goldfarb et al, 2007)。NaV1.7通道的突變會(huì)改變不同類型的神經(jīng)元的興奮性 (Rush et al, 2006)。在外周感覺神經(jīng)元中, 鈉通道參與炎癥性和神經(jīng)性疼痛 (Hains et al, 2004; Amir et al, 2006), 并且是多種藥物處理的靶點(diǎn) (Momin & Wood, 2008)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中, 缺血性腦損傷鈉通道α亞基的表達(dá)下調(diào), 而β1亞基能夠促進(jìn)神經(jīng)生長, β2亞基與多重硬化癥有關(guān) (Davis et al, 2004; O’Malley et al, 2009;Yao et al, 2005)。 這些都表明鈉通道在神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用。

目前只有較少的研究涉及到IL-1β對(duì)鈉通道的作用。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中, IL-1β與鈉通道都與炎癥和痛覺傳導(dǎo)有關(guān)。IL-1β增加痛覺感受器的興奮性,從而引起痛覺過敏 (Binshtok et al, 2008); 而鈉通道則是炎癥性痛覺過敏的效應(yīng)器(Amaya et al,2006)。慢性的IL-1β處理增強(qiáng)痛覺神經(jīng)元中的鈉電流, 這可能是 IL-1β對(duì)痛覺傳導(dǎo)作用的機(jī)制之一(Liu et al, 2006)。然而, 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中IL-1β與鈉通道的相互關(guān)系還不清楚。我們?cè)谝郧暗难芯恐邪l(fā)現(xiàn)10 ng/mL的IL-1β可以抑制大鼠皮層神經(jīng)元的電壓門控鈣電流和鉀電流。因此, 本研究使用了同樣劑量的 IL-1β, 研究其對(duì)皮層神經(jīng)元電壓門控鈉電流的急性作用。我們的結(jié)果顯示, IL-1β改變鈉電流的激活性質(zhì), 而電流幅度和失活性質(zhì)基本不變。由于激活性質(zhì)的改變, 也引起了動(dòng)作電位閾值的降低。這些結(jié)果顯示，IL-1β急性處理可能改變中樞神經(jīng)元的興奮性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠 (購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司), 飼養(yǎng)在動(dòng)物房中, 室溫維持在25 ℃左右, 保持12：12 h的晝夜節(jié)律。

1.2 大鼠皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)

取孕17～18 d的SD大鼠胎鼠, 斷頭, 取大腦皮層, 去除海馬和硬腦膜, 用0.25%的胰酶(Invitrogen,USA)在室溫下處理1～2 min, 吸出胰酶后, 用0.1%的胰酶抑制劑(Invitrogen, USA)終止消化。細(xì)胞懸液離心 10 min (900×g), 沉淀重懸于 Neurobasal(Invitrogen, USA)培養(yǎng)基中。使用臺(tái)盼藍(lán)排除法計(jì)數(shù)活細(xì)胞密度, 并用相同培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至0.75×106個(gè)/mL, 將細(xì)胞接種到35 mm的培養(yǎng)皿中的無菌蓋玻片上, 蓋玻片用 12.5 μg/mL 多聚賴氨酸(Poly-D-Lysine, Sigma, USA)預(yù)處理。

培養(yǎng)基使用Neurobasal (NB; Invitrogen, USA),在使用之前, 培養(yǎng)基中加入2 mmol/L的谷氨酰胺、50 U/mL的青霉素、50 μg/mL的鏈霉素, 以及2%的B-27添加劑(Invitrogen, USA)。將培養(yǎng)皿放在含有5 %CO2/95 %空氣的恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo, Japan)內(nèi),每3天半量換液。所有的記錄在神經(jīng)元體外培養(yǎng)的第6～10 d進(jìn)行。

1.3 全細(xì)胞膜片鉗記錄

使用P-97微電極拉制儀(Sutter, USA), 通過三步拉制, 從厚壁硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管(南京泉水儀器廠)制作微電極, 電極尖端阻抗5～10 M?。內(nèi)充電極內(nèi)液, 成分為(mmol/L)：145 CsCl, 1 MgCl2、10 HEPES、4 TEA-Cl、5 ATP-Na2和10 EGTA, 用CsOH調(diào)節(jié)pH值為7.2。將培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞取出置于含有細(xì)胞外液的培養(yǎng)皿中, 外液成分為(mmol/L)：140 NaCl、5 KCl、2 CaCl2、1 MgCl2、10 HEPES、10 葡萄糖, 用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.4。

全細(xì)胞電壓鉗記錄使用EPC-10膜片鉗放大器(HEKA, Germany)。形成全細(xì)胞模式后將神經(jīng)元鉗制在-80 mV, 以5 mV的電壓階躍進(jìn)行去極化刺激,持續(xù)時(shí)間20 ms, 范圍-80到65 mV。記錄前進(jìn)行慢電容及串聯(lián)電阻補(bǔ)償(60%～80%)。電流信號(hào)通過放大器后輸入計(jì)算機(jī) PatchMaster程序中, 采樣頻率是200 kHz。為了記錄動(dòng)作電位, 采用全細(xì)胞電流鉗模式。使用的外液與電壓鉗相同, 內(nèi)液成分為(mmol/L)：130葡萄糖酸鉀, 1 CaCl2、10 EGTA、2 MgCl2、10 HEPES、5 ATP-Na2、4 ATP-Mg、10磷酸肌酸t(yī)ris和0.1 GTP-Li4。在記錄前輸入超極化電流鉗制細(xì)胞在-70 mV左右, 然后輸入斜率去極化電流, 最大幅度500 pA持續(xù)時(shí)間100 ms, 以刺激產(chǎn)生動(dòng)作電位。采樣頻率200 kHz, 記錄并分析其幅度和閾值等性質(zhì)。

1.4 藥物處理

記錄到穩(wěn)定的正常鈉電流后, 在外液中加入10 ng/mL的 IL-1β, 繼續(xù)記錄電壓門控的鈉電流直到給藥后20 min。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用Clampfit 10.0軟件(Axon, USA)和 Excel進(jìn)行, 使用 Excel XP(Microsoft, USA)和SPSS 11.5(SPSS, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, Sigmaplot 10.0(SPSS, USA)軟件進(jìn)行作圖, 所有的數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)表示, 全部數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均使用平均值成對(duì)二樣本分析。

2 結(jié) 果

2.1 IL-1β對(duì)鈉電流幅度的作用

培養(yǎng) 6～10 d的大鼠胎鼠皮層神經(jīng)元用于膜片鉗記錄, 鉗制電壓在-80 mV, 以5 mV的去極化階躍到65 mV, 通過膜片鉗放大器記錄內(nèi)向鈉電流。在獲得穩(wěn)定的電流記錄之后, 外液中加入10 ng/mL的IL-1β, 繼續(xù)記錄直到給藥之后20 min。圖1是一個(gè)典型記錄, 通過放大器可以記錄到一個(gè)電壓依賴性的內(nèi)向電流, 并且具有快速激活和快速失活的性質(zhì), 符合電壓門控的鈉電流的特性。加入IL-1β后,電流幅度有逐漸減小的趨勢(shì)(圖1：A—C)。給藥前,鈉電流峰值出現(xiàn)在-25 mV, 因此, 使用-25 mV 下的電流幅度對(duì) IL-1β作用時(shí)間作圖, 可以看到在給藥后電流幅度隨著時(shí)間延長而下降(圖1D)。

圖1 來自一個(gè)細(xì)胞的IL-1β對(duì)鈉電流急性作用的典型記錄Fig. 1 A typical recording of the acute effect of IL-1β

我們總結(jié)了5個(gè)細(xì)胞所得到的數(shù)據(jù), 給藥前的峰值電流都出現(xiàn)在?25 mV, 因此，使用這個(gè)電壓下的平均電流幅度作圖。結(jié)果顯示, 使用 IL-1β處理后7 min, 電流幅度的降低開始具有顯著性差異, 在處理后15 min達(dá)到極顯著水平, 最大降幅是給藥20 min后降低到對(duì)照水平的80%(圖2A)。為了全面分析 IL-1β對(duì)鈉電流的作用, 使用電流幅度對(duì)測(cè)試電壓作圖, 獲得電流－電壓關(guān)系曲線。圖 2B是圖 1中典型例子的電流－電壓關(guān)系, 可以看到給藥前峰值電流出現(xiàn)在?25 mV, 給藥后10 min和20 min的曲線顯示峰值電流出現(xiàn)在?35 mV。這表明IL-1β處理后峰值電流的位置改變, 因此，重新統(tǒng)計(jì)了峰值電流, 其結(jié)果顯示，雖然 IL-1β處理后電流幅度仍然有下降的趨勢(shì), 但是沒有顯著性(圖2C)。

圖2 IL-1β對(duì)鈉電流幅度的作用Fig. 2 Effects of IL-1β on the amplitude of Na+ currents

2.2 IL-1β改變鈉電流的激活性質(zhì)

峰值電流的提前很可能是由于鈉通道的電生理學(xué)性質(zhì)發(fā)生了變化, 我們繼續(xù)分析了激活和失活性質(zhì)。圖3A是來自圖1中典型記錄的激活曲線, 在IL-1β處理后, 激活曲線向超極化方向平移, 這表明半激活電壓降低。統(tǒng)計(jì)顯示, 給藥后半激活電壓開始逐漸下降, 在3 min就已經(jīng)產(chǎn)生顯著差異, 5 min后差異達(dá)到極顯著水平(圖3B)。與半激活電壓下降不同, 斜率因子在給藥后沒有變化(圖 3C)。對(duì)于失活性質(zhì)的分析表明, 鈉通道的失活沒有改變(圖3D)。這些結(jié)果解釋了峰值電流提前的現(xiàn)象。

2.3 IL-1β改變動(dòng)作電位的性質(zhì)

鈉通道是再生性動(dòng)作電位產(chǎn)生的基礎(chǔ), 其激活性質(zhì)的改變很可能影響到動(dòng)作電位的性質(zhì)。因此,我們?cè)陔娏縻Q模式下, 使用斜率刺激記錄了神經(jīng)元的動(dòng)作電位。從典型記錄可以看出動(dòng)作電位的峰值幅度不變, 但時(shí)間提前, 而閾值則降低(圖 4A)。我們分析了4組記錄中的動(dòng)作電位, 峰值幅度沒有變化(圖 4B), 閾值顯著下降, 與半激活電壓的改變類似, 給藥后閾值持續(xù)降低, 處理3 min后, 就具有統(tǒng)計(jì)顯著性(圖4C)。這些結(jié)果表明, IL-1β處理通過改變鈉通道激活性質(zhì), 降低了動(dòng)作電位的閾值, 并由此提示可能增加神經(jīng)元的興奮性。

圖3 IL-1β改變鈉電流的激活性質(zhì)Fig. 3 IL-1β affects activation properties of Na+ currents

圖4 IL-1β對(duì)動(dòng)作電位的作用Fig. 4 Effects of IL-1β on action potential

3 討 論

最初我們對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析顯示, IL-1β顯著抑制了鈉電流幅度, 但進(jìn)一步的分析表明, 這是由于藥物處理后峰值電流提前。因此, 在給藥前的峰值電壓下的電流幅度有顯著降低, 而比較不同時(shí)間下的峰值電流則沒有顯著差異。達(dá)到峰值的電壓提前意味著激活性質(zhì)很可能發(fā)生改變, 對(duì)鈉通道激活和失活性質(zhì)的計(jì)算確認(rèn)了這一點(diǎn)。半激活電壓向超極化方向移動(dòng), 而激活性質(zhì)中的斜率因子和失活性質(zhì)則沒有變化。半激活電壓的降低解釋了峰值電流出現(xiàn)的提前, 幅度約為 10 mV, 同時(shí), 也提示電壓門控的鈉通道介導(dǎo)的動(dòng)作電位也會(huì)發(fā)生顯著改變。對(duì)動(dòng)作電位的記錄表明, 幅度沒有變化, 但是閾值顯著降低, 下降的幅度與半激活電壓改變的幅度接近。

3.1 IL-1β劑量的選擇

IL-1β在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種損傷和疾病過程中發(fā)揮重要作用。已經(jīng)有一些研究報(bào)道了IL-1β與不同的離子通道之間的相互關(guān)系, 包括 IL-1β對(duì)海馬神經(jīng)元鈣通道 (Plata-Salamán & ffrench-Mullen,1992) 和中樞, 以及外周神經(jīng)元的鉀通道 (Takeda et al, 2008; Zhang et al, 2008) 的急性作用?，F(xiàn)在已有Zhou et al (2006a, b) 有關(guān)IL-1β對(duì)皮層鈣通道和Liu et al (2006) 對(duì)外周神經(jīng)元鈉通道的慢性作用的研究; 但是還沒有關(guān)于 IL-1β對(duì)皮層神經(jīng)元鈉通道急性作用的相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)中選擇了 10 ng/mL的濃度進(jìn)行處理, 這是一個(gè)比較適當(dāng)?shù)膭┝?。Zhou et al (2006a) 指出, 在病理學(xué)條件下腦脊液中的IL-1β濃度超過100 pg/mL, 在有活性的局部分泌區(qū)域中, IL-1β的濃度可能會(huì)高出兩個(gè)數(shù)量級(jí), 最大達(dá)到10 ng/mL。我們以前關(guān)于IL-1β對(duì)離子通道的慢性作用的研究也使用了10 ng/mL的濃度, 發(fā)現(xiàn)該劑量的IL-1β可以抑制中樞神經(jīng)元中的鈣電流 (Zhou et al, 2006a, b) 以及鉀電流(Zhang et al, 2009)。因此,本實(shí)驗(yàn)中將IL-1β的濃度設(shè)定為10 ng/mL。

3.2 IL-1β急性作用的可能的生物學(xué)意義

本文的研究結(jié)果表明, IL-1β對(duì)于中樞離子通道具有急性作用, 但與其抑制電流幅度的慢性作用結(jié)果不同, 急性作用對(duì)幅度的抑制較小, 主要影響鈉通道的激活性質(zhì); 而慢性作用則是通過抑制表達(dá)減少通道數(shù)量。因此, 只影響幅度而不改變激活性質(zhì)。通過改變激活性質(zhì), IL-1β也急性改變了動(dòng)作電位的閾值, 而這是神經(jīng)元興奮性的重要指標(biāo)。在外周痛覺傳導(dǎo)神經(jīng)元中, IL-1β顯著降低動(dòng)作電位的閾值,從而造成神經(jīng)元興奮性增加, 這是炎癥性疼痛或者痛敏的重要機(jī)制 (Binshtok et al, 2008)。

在不同的處理?xiàng)l件下, IL-1β對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)或者神經(jīng)毒性作用, 對(duì)于離子通道的影響可能是IL-1β發(fā)揮其生物學(xué)功能的重要途徑之一。在視神經(jīng)損傷后, IL-1β可以抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的鈉和鉀通道, 從而產(chǎn)生保護(hù)作用 (Diem et al, 2003)。中樞神經(jīng)元興奮性增加, 則可能造成神經(jīng)元過度興奮, 釋放過多的興奮性神經(jīng)遞質(zhì), 例如谷氨酸, 造成進(jìn)一步的損傷。IL-1β對(duì)離子通道的作用也非常復(fù)雜, 在外周神經(jīng)元中, IL-1β急性處理抑制鈉電流, 而慢性處理則會(huì)增加鈉電流 (Liu et al,2006)。因此, 對(duì)IL-1β與離子通道以及神經(jīng)元電學(xué)性質(zhì)的相互關(guān)系還需要深入研究。

總之, 我們的研究表明, IL-1β急性處理通過改變鈉通道激活性質(zhì)降低了神經(jīng)元閾值, 增加了興奮性。在損傷和疾病過程中IL-1β表達(dá)快速上調(diào)。因此, 產(chǎn)生的興奮性增加可能會(huì)惡化興奮毒性, 從而造成神經(jīng)毒性作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步闡明 IL-1β的作用及其機(jī)制打下了基礎(chǔ)并提供了新的思路。

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Acute effects of IL-1β on sodium current in cortical neurons of rats

QI Cui1, ZHANG Wei-Wei2, WANG Fei1, BAO Chao-Fei1, WANG Xin-Wei1,LI Xiao-Nan1, YU Xiao-Qing1, ZHOU Chen1,*

(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding071002,China; 2.School of Basic Medical Science,Hebei University,Baoding071000,China)

Interleukin-1β (IL-1β) is an important proinflammatory cytokine that plays a key role in injuries and diseases of the central nervous system (CNS). The voltage-gated Na+channel is the most important ion channel of neurons, and is essential for regenerative action potential (AP). The Na+channel also contributes to many diseases of the brain. However, relations between IL-1β and central Na+channels remain unreported. In this study, whole cell patch-clamp recording was used to investigate the acute effects of IL-1β (10 ng/mL) on voltage-dependent Na+currents and AP of cultured cortical neurons from rats. Results showed that the half-activation voltage of Na+channels and the threshold of AP, but not the amplitude, slope factor of activation, and inactivation properties, were affected by IL-1β.These data suggest that increased IL-1β in injury and disease may upregulate the excitability of neurons, and thereby exacerbate neurotoxicity.

Interleukin-1β; Cortical neurons; Voltage-dependent Na+currents; Patch-clamp recording

Q424; Q426; R338.2

A

0254-5853-(2011)03-0323-06

10.3724/SP.J.1141.2011.03323

2010-09-25；接受日期：2011-01-28

河北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃(Z2009109); 北京大學(xué)生物膜與膜生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題?

Corresponding author)，E-mail: zezhou@sina.com