雙酚A誘導(dǎo)雄性中國(guó)林蛙肝細(xì)胞雌激素受體表達(dá)和卵黃蛋白原合成

白 瑤, 張育輝, 翟麗麗, 李忻怡, 楊 君, 洪燕燕

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710062)

雙酚A誘導(dǎo)雄性中國(guó)林蛙肝細(xì)胞雌激素受體表達(dá)和卵黃蛋白原合成

白 瑤, 張育輝*, 翟麗麗, 李忻怡, 楊 君, 洪燕燕

(陜西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 陜西 西安 710062)

為探討雙酚A(bisphenol A, BPA)對(duì)雄性兩棲動(dòng)物肝細(xì)胞中雌激素受體(estrogen receptor, ER)表達(dá)和卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)合成的影響, 將中國(guó)林蛙(Rana chensinensis)雄性成體分別持續(xù)暴露于 10-7、10-6、10-5mol/L BPA水體中10、20、30 d, 設(shè)10-9、10-8mol/L雌二醇(E2)為陽性對(duì)照。用原位雜交技術(shù)檢測(cè)ER mRNA在肝細(xì)胞中的表達(dá)定位，用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)肝細(xì)胞中ER和VTG蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示, 各BPA和E2處理組肝細(xì)胞中均有ER mRNA陽性反應(yīng), ER和VTG蛋白的表達(dá)相對(duì)值均顯著高于空白對(duì)照組。在同一暴露時(shí)間, ER和VTG表達(dá)值是隨著BPA濃度的增加呈增高趨勢(shì)。在同一BPA濃度, VTG表達(dá)值是隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)呈增高趨勢(shì), 而ER表達(dá)值則無顯著性變化。這些表明BPA可以通過誘導(dǎo)雄性中國(guó)林蛙肝細(xì)胞的ER高調(diào)導(dǎo)致VTG合成, 但其效應(yīng)遠(yuǎn)低于E2。

雙酚A; 肝細(xì)胞; 雌激素受體; 卵黃蛋白原; 中國(guó)林蛙

內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals,EDCs)是指干擾機(jī)體正常的內(nèi)分泌機(jī)能, 并影響其生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和行為的外源性化學(xué)物質(zhì)。EDCs可通過影響激素的合成、分泌、包裝、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)等影響人和動(dòng)物體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)、生殖、發(fā)育和行為。雙酚A(bisphenol A, BPA)作為化工原料, 被廣泛應(yīng)用于聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂等高分子材料的生產(chǎn)過程中。已有研究報(bào)道, BPA屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一。

雌激素受體(estrogen receptor, ER)與雌激素結(jié)合參與啟動(dòng)雌激素應(yīng)答元件轉(zhuǎn)錄, 使雌激素發(fā)揮效應(yīng)。ER的水平也可間接反映外源性化學(xué)物質(zhì)是否具有雌激素效應(yīng)(Yamaguchi et al, 2005)。在卵生脊椎動(dòng)物, 卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)受內(nèi)源性雌激素的調(diào)節(jié), 在肝細(xì)胞中合成并釋放到血液中。雄性卵生脊椎動(dòng)物在外源雌激素的誘導(dǎo)下也可合成VTG。因此, 雄性動(dòng)物體內(nèi)卵黃蛋白原的異常生成可作為一種生物標(biāo)志物檢測(cè)環(huán)境化學(xué)污染的雌激素效應(yīng)(Andrew et al, 2007)。

BPA對(duì)水生動(dòng)物ER和VTG的影響已有報(bào)道,將非洲爪蟾(Xenopus laevis)蝌蚪暴露于BPA水體可誘導(dǎo)雌性比例升高, 體內(nèi) ER mRNA表達(dá)高調(diào)(Levy et al, 2004)。魚類在一定濃度范圍的BPA水體暴露后, 肝臟 ER mRNA表達(dá)水平也增高(Yamaguchi et al, 2005; Seo et al, 2006)。這些均表明BPA可誘導(dǎo)肝細(xì)胞ER的表達(dá)增加。另外, 在雄性爪蟾(X. laevis)和歐洲林蛙(Rana temporaria)BPA暴露處理后(Bogi et al, 2003), 給雄性東方鈴蟾(Bombina orientalis)注射BPA后(Gye & Kim, 2005),動(dòng)物肝細(xì)胞中VTG mRNA的表達(dá)量均增加。在魚類也有相似的研究結(jié)果(Sohoni et al, 2001;Lindholst et al, 2003)。上述研究結(jié)果可見, BPA誘導(dǎo)雄性卵生動(dòng)物肝細(xì)胞的VTG合成可能與高調(diào)ER相關(guān), 但這些報(bào)道對(duì)VTG和ER的檢測(cè)大多數(shù)都不在同一動(dòng)物完成。本實(shí)驗(yàn)將雄性中國(guó)林蛙(Rana chensinensis)暴露于BPA水體后, 同時(shí)檢測(cè)肝細(xì)胞中ER和VTG表達(dá), 探討B(tài)PA對(duì)雄性兩棲動(dòng)物肝細(xì)胞中ER和VTG表達(dá)的影響及其兩者之間的關(guān)系, 從而深入理解BPA對(duì)雄性兩棲動(dòng)物產(chǎn)生的雌激素效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

BPA 的純度＞98%(上?；瘜W(xué)試劑公司); E2為17β-雌二醇(Sigma公司); ER一抗為ER α兔抗鼠多克隆抗體(Santa Cruz公司); VTG一抗為兔抗魚多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB顯色劑(Boster 公司);堿性磷酸酶偶聯(lián)抗 DIG抗體、NBT/BCIP顯色劑(Roche公司); 焦碳酸二乙酯(DEPC)、山羊血清(Sigma 公司)。

中國(guó)林蛙(Rana chensinensis)于2008年10月采自秦嶺北坡的西安市長(zhǎng)安大峪水庫附近。選取雄性成體育齡蛙108例, 體重為6.72～7.21g。

1.2 暴露實(shí)驗(yàn)

按照爪蟾的BPA暴露濃度(Iwamuro et al, 2003),將雄性林蛙隨機(jī)分為 6組, 包括 10-7、10-6、10-5mol/L BPA, 用10-9和10-8mol/L E2處理作為陽性對(duì)照組, 用自來水作為空白對(duì)照。每組放置6例, 設(shè)3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)室水族箱飼養(yǎng), 每箱加曝氣72 h以上的自來水2 L, 水深浸沒全部蛙體, 每48 h換水一次。用面包蟲飼喂, 每日保證12 h光照。

分別暴露10、20、30 d后, 每組每次取6例麻醉后剖腹, 取部分肝臟用中性福爾馬林溶液固定24 h, 供ER和VTG的免疫組織化學(xué)檢測(cè); 另取部分肝臟用4%多聚甲醛溶液固定24 h, 供ER的原位雜交檢測(cè)。常規(guī)石蠟切片, 厚8 μm, 裱在涂有0.05%多聚賴氨酸處理的載玻片上, 室溫干燥24 h, 37 ℃烘片48 h, 4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 原位雜交檢測(cè)

依據(jù)美洲豹蛙(Rana pipiens)雌激素受體α(estrogen receptor α)(DQ398027)和非洲爪蟾(X. laevis)雌激素受體 α1(estrogen receptor α1) (LOC398734)基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)地高辛標(biāo)記的探針, 反義探針序列為：5'-CATTCCCACTTCATAGCATTTTCTGAGT CGGCAGGCTTGACA -3'。

主要步驟：常規(guī)脫蠟、復(fù)水; 0.1% DEPC處理;0.1 mol/L甘氨酸/PBS漂洗; 0.3%TritonX-100/ PBS浸片; 2.5 mg/mL胃蛋白酶37 ℃消化; 4%多聚甲醛固定; 0.25%乙酸酐浸片; 37 ℃預(yù)雜交液孵育; 0.2×SSC漂洗; 42 ℃雜交24 h; 4×SSC 42 ℃漂洗; 37 ℃分別用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC漂洗; 緩沖液-1(0.1 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl, pH7.5)漂洗;山羊血清封閉液37 ℃孵育; 抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物 37 ℃孵育; 緩沖液-2(0.1 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2, pH7.5)漂洗; 緩沖液-3(0.1 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L NaCl,0.05 mol/L MgCl2, pH9.5)漂洗; 加顯色液避光顯色;緩沖液-4(0.01 mol/L Tris-HCl, 0.001 mol/L EDTA,pH8.1)漂洗; 常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢、拍照。陰性對(duì)照采用正義探針的稀釋液代替探針孵育, 其余步驟相同。

鏡檢陽性反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)：在胞質(zhì)和核膜上藍(lán)色顆粒為陽性, 陰性對(duì)照為無色。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

常規(guī)SABC法：切片常規(guī)脫蠟、復(fù)水; 3%H2O2浸片10 min; 0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)微波修復(fù)15 min; PBS漂洗3×5 min; 山羊血清室溫封閉20 min; 分別加ER或VTG一抗, 濕盒中4 ℃孵育過夜; PBS漂洗 3×5 min; 滴加生物素化羊抗兔IgG, 37 ℃孵育 30 min; PBS漂洗 3×5 min; 滴加SABC復(fù)合物, 37 ℃孵育30 min; PBS漂洗4×5 min;DAB顯色5 min。常規(guī)脫水、透明、封片、鏡檢、拍照。陰性對(duì)照用抗體稀釋液代替一抗孵育, 其余步驟相同。

鏡檢陽性反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)：胞質(zhì)和胞核內(nèi)棕黃色顆粒明顯深于背景底色為陽性, 陰性對(duì)照為無色。

1.5 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)分析

每組取 6例樣本, 每例做 3張切片, 用 Leica CAMER圖像采集系統(tǒng)(Lecia Qwin V3)采集圖像。用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組織化學(xué)陽性產(chǎn)物進(jìn)行半定量檢測(cè), 測(cè)定視野中 30個(gè)細(xì)胞陽性免疫反應(yīng)的光密度值, 著色程度越深, 光密度值越大。以光密度值作為陽性反應(yīng)產(chǎn)物表達(dá)相對(duì)值。

用 Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)所得數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布后, 將 BPA和 E2的濃度作為處理因子進(jìn)行單因素方差分析(one way-ANOVE), 顯著性水平設(shè)置為α=0.05。同一濃度不同處理時(shí)間的多重比較采用Duncan檢驗(yàn)。各組數(shù)據(jù)均用Mean±SD表示, 所有數(shù)據(jù)處理和制圖均使用SPSS 16.0軟件。

2 結(jié) 果

2.1 BPA暴露后ER mRNA及ER在肝細(xì)胞的表達(dá)

2.1.1 ER mRNA在肝細(xì)胞的表達(dá) 原位雜交法檢測(cè)顯示, BPA和E2處理后肝細(xì)胞核膜和胞質(zhì)中均存在 ER陽性反應(yīng), 呈藍(lán)色。對(duì)照組胞質(zhì)中陽性反應(yīng)著色很淺, 胞核無陽性反應(yīng)(圖 1-1)。BPA 處理組中ER陽性反應(yīng)著色相對(duì)較淺(圖1-2), 而E2處理組胞核和胞質(zhì)中陽性顆粒相對(duì)較多, 顏色較深(圖1-3)。

2.1.2 ER在肝細(xì)胞的表達(dá) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示, 對(duì)照組肝細(xì)胞中 ER陽性反應(yīng)較弱(圖 1-4), 在各BPA處理組的肝細(xì)胞中ER陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈較淺的棕黃色片狀或顆粒狀(圖1-5), 在E2處理組, 肝細(xì)胞的ER陽性反應(yīng)產(chǎn)物為較深的棕黃色(圖1-6)。

圖1 林蛙雙酚A暴露后雌激素受體和卵黃蛋白原在肝細(xì)胞的陽性反應(yīng)Fig. 1 Positive effect of ER and VTG on hepatocytes of Rana chensinensis exposed to BPA

ER陽性反應(yīng)表達(dá)相對(duì)值的半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖2), 與相同處理時(shí)間的對(duì)照組相比, 10-7mol/L BPA處理組中肝細(xì)胞的 ER表達(dá)相對(duì)值顯著增高(P＜0.05), 10-6、10-5mol/L BPA和E2處理組的ER增高極顯著(P＜ 0.01), 即BPA和E2在處理時(shí)間相同時(shí),ER隨著BPA和E2濃度的升高顯著上調(diào)。

圖2 雙酚A暴露后林蛙肝細(xì)胞中雌激素受體表達(dá)相對(duì)值的比較Fig. 2 Comparisons on relative intensity of ER expression in hepatocytes of Rana chensinensis exposed to BPA

比較不同處理時(shí)間的 ER表達(dá)相對(duì)值, 對(duì)照組在10、20和30 d的ER表達(dá)值差異不顯著(P＞0.05)。BPA各處理組暴露10、20、30 d后, ER表達(dá)值差異也不顯著(P＞0.05)。但在10-8mol/L E2組, 暴露30 d與10、20 d相比, ER表達(dá)值是顯著增高(P＜0.05); 在10-9mol/L E2組暴露20、30 d, 與10 d相比, ER表達(dá)值是顯著降低(P＜0.05)。從總體趨勢(shì)上看, ER表達(dá)值不隨暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。

2.2 BPA暴露后VTG在肝細(xì)胞的表達(dá)

在各BPA和E2處理組, 肝細(xì)胞中均有VTG表達(dá), VTG陽性反應(yīng)在胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒狀或片層狀(圖1-8, 9), 對(duì)照組無明顯的陽性反應(yīng)(圖1-7)。

VTG陽性反應(yīng)表達(dá)相對(duì)值的半定量統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(圖3), 與相同處理時(shí)間的對(duì)照組相比, 各BPA和E2處理組肝細(xì)胞的VTG陽性反應(yīng)的表達(dá)值均顯著增高。其中10-7mol/L BPA處理10、20 d時(shí), VTG表達(dá)值增高顯著(P＜0.05), 其余各組增高是極顯著(P＜0.01), 可見VTG表達(dá)隨著BPA和E2濃度的增高有增加趨勢(shì)。

圖3 雙酚A暴露后林蛙肝細(xì)胞中卵黃蛋白原表達(dá)相對(duì)值比較Fig. 3 Comparisons of the relative intensity of VTG expression in hepatocytes of R. chensinensis exposed to BPA

在不同處理時(shí)間, 對(duì)照組在 10、20、30 d的VTG 反應(yīng)變化不顯著(P＞0.05)。在處理組, 10-5mol/L BPA暴露 20 d, VTG表達(dá)相對(duì)值顯著增加(P＜0.05), 但在 30 d時(shí)又顯著降低(P＜0.05)。10-6mol/L BPA暴露30 d, VTG表達(dá)值較10 d顯著增加(P＜0.05)。10-7mol/L BPA暴露30 d, VTG表達(dá)值較10、20 d 顯著增加(P＜0.05)。10-8mol/L E2暴露 20、30 d, VTG表達(dá)值較 10 d顯著增加(P＜0.05); 10-9mol/L E2組的VTG表達(dá)值均較前一時(shí)期顯著增加(P＜0.05)。

3 討 論

3.1 BPA對(duì)雄性林蛙肝細(xì)胞ER表達(dá)的影響

ER是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子, 通過雌激素應(yīng)答元件調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。E2在靶細(xì)胞中與 ER結(jié)合為 E2-ER復(fù)合物, 再與雌激素反應(yīng)元件結(jié)合,可啟動(dòng)或改變基因的轉(zhuǎn)錄。E2可誘導(dǎo)肝細(xì)胞 ER mRNA的表達(dá), 進(jìn)而可誘導(dǎo) VTG雌激素反應(yīng)元件的表達(dá)(Pakel, et al, 1991; Klinge, 2001)。

BPA為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物, 具有雌激素樣效應(yīng)。BPA的雌激素效應(yīng)與ER的活化相關(guān), 其機(jī)制包括導(dǎo)致ER上調(diào)、雌激素結(jié)合蛋白以及內(nèi)源雌激素的合成和分泌的改變, BPA又可通過與ER的結(jié)合改變雌激素反應(yīng)的基因表達(dá)(Bowman et al, 2002;Andrew et al, 2007)。在新生雄性大鼠, BPA可使精原細(xì)胞或精母細(xì)胞內(nèi)的ER表達(dá), 被認(rèn)為是BPA誘導(dǎo)ER mRNA的表達(dá)水平升高(Takao et al, 2003)。BPA水體暴露可誘導(dǎo)爪蟾(X. laevis)蝌蚪體內(nèi)ER mRNA的水平明顯升高, 蝌蚪雌性比例升高(Levy et al, 2004)。用不同濃度BPA暴露處理雄性青鳉(Oryzias latipes)和花斑溪鳉(Rivulus marmoratus),肝臟ER mRNA表達(dá)水平的上升依賴于一定范圍的BPA 濃度(Yamaguchi et al, 2005; Seo et al, 2006)。這些表明 BPA可誘導(dǎo) ER的表達(dá), 從而發(fā)揮雌激素效應(yīng)。在本實(shí)驗(yàn), 對(duì)雄性中國(guó)林蛙進(jìn)行 BPA和E2暴露后, 原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示的ER mRNA與免疫組織化學(xué)檢測(cè)的ER表達(dá)細(xì)胞定位一致。對(duì)ER表達(dá)相對(duì)值的測(cè)定可見, 在相同的處理時(shí)間, ER表達(dá)是隨著 BPA和 E2處理濃度的升高而顯著上調(diào),表明BPA和E2誘導(dǎo)ER的表達(dá)高調(diào)的作用相似, 可啟動(dòng)ER基因轉(zhuǎn)錄。隨著BPA和E2暴露時(shí)間的延長(zhǎng), 肝細(xì)胞的 ER表達(dá)未呈現(xiàn)一直增高的趨勢(shì)。這說明機(jī)體在外源性激素或激素樣化合物的作用下,ER的表達(dá)水平仍存在自身的調(diào)節(jié)機(jī)制, 其合成不會(huì)無節(jié)制地增加(Bowman et al, 2002)。

比較BPA與E2的雌激素活性, 據(jù)報(bào)道, BPA與ER的結(jié)合能力僅是 E2的 1/2 000(Krishnan et al,1993), BPA 引起效應(yīng)的量通常為 E2的 103～105倍(Matthews et al, 2001; Kloas et al, 2000)。本實(shí)驗(yàn)所采用的BPA濃度范圍比E2高2～3個(gè)數(shù)量級(jí), 而E2處理組的 ER表達(dá)值仍高于 BPA 處理組, 表明 BPA雖然與E2同樣可高調(diào)ER表達(dá), 但BPA的雌激素效應(yīng)遠(yuǎn)低于E2。

3.2 BPA對(duì)雄性林蛙肝細(xì)胞中VTG的影響

VTG是卵生動(dòng)物卵黃蛋白的前體, VTG基因?qū)儆诖萍に貞?yīng)答元件, E2-ER結(jié)合可啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄(Pakel et al, 1991; Denslow et al, 2001)。正常雄性個(gè)體的體內(nèi)很少或不產(chǎn)生VTG, 但在外源性雌激素或類似物的誘導(dǎo)下, 卵生動(dòng)物的雄性個(gè)體或幼體的肝細(xì)胞也可合成VTG(Denslow et al, 1999; Mitsui et al, 2007)。用BPA處理雄性非洲爪蟾(X. laevis)的原代培養(yǎng)肝細(xì)胞, 表明VTG mRNA的表達(dá)與BPA劑量和時(shí)間存在依賴關(guān)系(Kloas et al, 1999)。雄性東方鈴蟾(Bombina orientalis)注射 BPA, 可誘導(dǎo)肝臟 VTG mRNA的表達(dá)(Gye & Kim, 2005)。在魚類, 對(duì)雄性黑頭呆魚(Pimephales promelas)、虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)進(jìn)行BPA水體暴露, VTG合成量是隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而增加(Sohoni et al,2001; Lindholst et al, 2003)。本實(shí)驗(yàn)所選用BPA和E2的暴露濃度為顯著效應(yīng)濃度, 在短時(shí)間內(nèi)能誘導(dǎo)雄性林蛙肝細(xì)胞中VTG的生成。對(duì)VTG表達(dá)相對(duì)值的測(cè)定可見, 在相同的處理時(shí)間, VTG合成量是隨BPA和E2濃度的升高而增加, 表明VTG的合成與BPA和E2的作用密切相關(guān)。在處理濃度相同時(shí),隨著BPA和E2暴露時(shí)間的延長(zhǎng), VTG在肝細(xì)胞中的表達(dá)量也呈現(xiàn)增高趨勢(shì)。這些實(shí)驗(yàn)均顯示, BPA可誘導(dǎo)雄性卵生動(dòng)物肝細(xì)胞 VTG 的合成, 其合成量對(duì)雌激素或類雌激素的劑量和處理時(shí)間存在依賴關(guān)系。但是, 本實(shí)驗(yàn)中10-5mol/L BPA組處理30 d后, VTG表達(dá)水平有所降低, 可能是由于林蛙長(zhǎng)時(shí)間處于較高濃度的BPA水體中, 體內(nèi)的BPA量積累較多, 導(dǎo)致肝細(xì)胞受損, 從而影響 VTG合成功能。類似現(xiàn)象在尖頭鱥(Phoxinus oxycephalus)的BPA暴露水體中也被報(bào)道(Park et al, 2003)。

有關(guān)BPA的雌激素效應(yīng)濃度, 在BPA處理小鼠胚胎的實(shí)驗(yàn)表明, 10-8～10-6mol/L BPA 可產(chǎn)生雌激素效應(yīng), 而10-4mol/L BPA卻起抑制作用(Takai et al, 2000)。用 10-4mol/L BPA對(duì)歐洲林蛙(R.temporaria)原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞處理后, 其VTG的合成沒有發(fā)生變化, 其原因被解釋為BPA與ER的結(jié)合能力很弱(Rouhani et al, 2005)。本實(shí)驗(yàn)中BPA水體暴露所采用的濃度范圍為10-7～10-5mol/L, 與多數(shù)暴露實(shí)驗(yàn)所采用的 BPA濃度及所得到的結(jié)果相近?？梢夿PA只有在一定的濃度范圍內(nèi)才可發(fā)揮較強(qiáng)的雌激素活性。而上述用 10-4mol/L BPA在細(xì)胞培養(yǎng)中沒有引起相應(yīng)的激素效應(yīng)效果的原因,是屬于處理方式的差異還是處理濃度過高, 有待探討。

有關(guān)BPA誘導(dǎo)ER表達(dá)高調(diào)和VTG異常合成的機(jī)制, 通過對(duì)雄性虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)肝細(xì)胞離體培養(yǎng)研究表明, 外源雌激素可上調(diào) ER的表達(dá), 同時(shí)使 VTG mRNA 的表達(dá)增加, 認(rèn)為VTG mRNA的表達(dá)依賴于ER的水平(Flouriot et al,1997)。通過BPA對(duì)MCF-7細(xì)胞的雌激素效應(yīng)研究認(rèn)為, BPA的作用途徑主要通過ER介導(dǎo), BPA濃度過高則與 ER的結(jié)合達(dá)到飽和, 將不能檢測(cè)到濃度改變所引起的效應(yīng)(Welshons et al, 2003)。本實(shí)驗(yàn)在一定的BPA濃度范圍暴露處理雄性中國(guó)林蛙, 肝細(xì)胞的ER表達(dá)和VTG合成均隨BPA濃度增大呈現(xiàn)增高趨勢(shì), 表明VTG的表達(dá)依賴于ER的水平, BPA可能通過誘導(dǎo)ER途徑促使VTG合成。VTG可隨著BPA暴露時(shí)間的延長(zhǎng)增高, 但ER的表達(dá)未隨時(shí)間的延長(zhǎng)發(fā)生顯著變化。BPA具有與 E2相似的雌激素效應(yīng), 但其效應(yīng)遠(yuǎn)低于E2。

Andrew CD, Marcus E, Taisen I, Susan J, Hans L, Gerald A, Le Blanc,Louis J, Guillette J. 2007. An ecological assessment of bisphenol A:Evidence from comparative biology[J].Reprod Toxicol, 24: 225-239.

Bowman CJ, Kroll KJ, Gross TG, Denslow ND.2002. Estradiol-induced gene expression in largemouth bass (Micropterus salmoides) [J].Mol Cell Endocrin, 196(1-2): 67-77.

Bogi C, Schwaiger J, Ferling H, Mallow U, Steineck C, Sinowatz F, Kalbfus W, Negele RD, Lutz I, Kloas W. 2003. Endocrine effects of environmental pollution onXenopus laevisandRana temporaria[J].Environ Res, 93: 195-201.

Denslow ND, Chow MC, Kroll KJ, Green L. 1999. Vitellogenin as a bio-marker of exposure for estrogen or estrogenic mimics[J].Ecotoxicology,8(5): 385-398.

Denslow ND, Bowman CJ, Ferguson RJ, Lee HS, Hemmer MJ, Folmar LC.2001. Induction of gene expression in sheeps head minnows(Cyprinodon variegatus) treated with 17β-estradiol, diethylstilbetrol, or ethinylestradiol: the use of mRNA fingerprints as an indicator of gene regulation[J].Gen Comp Endocrinol, 121(3): 250-260.

Flouriot G, Pakdel F, Ducouret B, Ledrean Y, Valotaire Y. 1997. Differential regulation of two genes implicated in fish reproduction: vitellogenin and estrogen receptor genes[J].Mol Reprod Dev, 48(3): 317-323.

Gye MC, Kim DH. 2005. Bisphenol A induces hepatic vitellogenin mRNA in maleBombina orientalis[J].Bull Environ Contam Toxicol, 75: 1-6.

Iwamuro S, Sskakibara M, Terao M, Ozawa A, Kurobre C, Shigeura T, Kato M, Kikuyama S. 2003. Teratogenic and anti-metamorphic effects of bisphenol A on embryonic and larvalXenopus laevis[J].Gen Comp Endocrinol, 133(2): 189-198.

Klinge CM. 2001. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements[J].Nucl Acids Res, 29(14): 2905-2919.

Kloas W, Einspanier R, Lutz I. 1999. Amphibians as a model to study endocrine disrupters: II. estrogenic activity of environmental chemicalsin vitroandin vivo[J].Sci Total Environ, 225(1-2): 59-68.

Kloas W, Schrag B, Ehnes C, Segner H. 2000. Binding of xenobiotics to hepatic estrogen receptor and plasma sex steroid binding protein in the teleost fish, the carp (Cyprinus carpio)[J].Gen Comp Endocrinol, 119:287-299.

Krishnan AV, Stathis P, Permuth SF, Tokes L, Feldman D．1993. Bisphenol A：an estrogenic substance is released from polycarbonate flasks during autoclaving[J]．Endocrinology, 132: 2279-2286.

Levy G, Lutz I, Krüger A, Kloas W. 2004. Bisphenol A induces feminization in Xenopus laevistadpoles[J].Environ Res, 94(1): 102-111.

Lindholst C, Wynne P M, Marriott P, Pedersen S N, Bjerregaard P. 2003.Metabolism of bisphenol A in zebrafish (Danio rerio) and rainbow trout (Oncorhynchus Mykiss) in relation to estrogenic response[J].Comp Biochem PhysiolC:Toxicol Pharmacol, 135: 169-177.

Matthews JB, Twomey K, Zacharewski TR. 2001.In vitroandin vivointeractions of bisphenol A and its metabolite, bisphenol A glucuronide with estrogen receptors alpha and beta[J].Chem Res Toxicol, 14: 149-157.

Mitsui N, Tooi O, Kawahara A. 2007.Vitellogenin-inducing activities of natural, synthetic, and environmental estrogens in primary culturedXenopus laevishepatocytes[J].Comp Biochem PhysiolC:Toxicol Pharmacol, 146:581–587.

Pakel F, Féon S, Gac FL, Menn FL, Valotaire Y. 1991. In vivo estrogen induction of hepatic estrogen receptor mRNA and correlation with vitellogenin mRNA in rainbow trout[J].Mol Cell Endocrinol, 75:205-212.

Park CB, Kim BH, Na OS, Choi YC, Lee YD, Baek HJ, Kim HB, Takemura A. 2003. Induction ofin vitrovitellogenin synthesis by bisphenol A,nonylphenol and octylphenol in Chinese minnow (Phoxinus oxycephalus) hepatocytes[J].Korean J Biol Sci, 7: 227-235.

Rouhani RT, Sanderson JT, Van HI, Van KP, Bosveld AT, Vanden BM. 2005.Effects of environmental and natural estrogens on vitellogenin production in hepatocytes of the brown frog (Rana temporaria)[J].Aquat Toxicol, 71: 97-101.

Seo JS, Lee YM, Jung SO, Kim IC, Yoon YD, Lee JS. 2006. Nonylphenol modulates expression of androgen receptor and estrogen receptor genes differently in gender types of the hermaphroditic fishRivulus marmoratus[J].Biochem Biophys Res Commun, 346(1): 213-223.

Sohoni P, Tyler CR, Hurd K, Caunter J, Hetheridge M, Williams T, Woods C,Evans M, Toy R, Gargas M, Sumpter JP. 2001. Reproductive effects of long-term exposure to bisphenol A in the fathead minnow (Pimephales promelas)[J].Environ Sci Technol, 35 (14): 2917-2925.

Takai Y, Tsutsumi O, Ikezuki Y, Hiroi H, Osuga Y, Momoeda M, Yano T,Taketani Y. 2000. Estrogen receptor-mediated effects of a xenoestrogen,bisphenol A, on preimplantation mouse embryos[J].Biochem Biophys Res Commun, 270(3): 918-921.

Takao T, Nanamiya W, Nazarloo HP, Matsumoto R, Asaba K, Hashimoto K.2003. Exposure to the environmental estrogen bisphenol A differentially modulated estrogen receptor-α and-β immunoreactivity and mRNA in male mouse testis[J].Life Sci, 72(10): 1159-1169.

Welshons WV, Thayer KA, Judy BM, Taylor JA, Curran EM, Vom Saal FS.2003. Large effects from small exposures. I. Mechanisms for endocrine-disrupting chemicals with estrogenic activity[J].Environ Health Perspect, 111(8): 994-1006.

Yamaguchi A, Ishibashi H, Kohra S, Arizono K, Tominaga N. 2005.Short-term effects of endocrine-disrupting chemicals on the expression of estrogen-responsive genes in male medaka (Oryzias latipes)[J].Aquat Toxicol, 72(3): 239-249.

Estrogen receptor expression and vitellogenin synthesis induced in hepatocytes of male frogsRana chensinensisexposed to bisphenol A

BAI Yao, ZHANG Yu-Hui*, ZHAI Li-Li, LI Xin-Yi, YANG Jun, HONG Yan-Yan

(College of Life Science,Shaanxi Normal University,Xi’an710062,China)

The effects of bisphenol A (BPA) on estrogen receptor (ER) and vitellogenin (VTG) in hepatocytes of male amphibians have attracted significant attention in recent years. Adult male frogsRana chensinensiswere exposed to different concentrations of 10-7, 10-6and 10-5mol/L BPA consecutively for 10, 20, and 30 d, respectively. We used 10-9,10-8mol/L 17β-esradiol (E2) as positive controls. The expressions of ER mRNA in the hepatocytes were detected byin situhybridization, and ER and VTG protein were detected by immunohistochemistry. The results showed that positive effects of ER mRNA were detected in all BPA and E2treatment groups. Compared with the control group, the expression level of ER and VTG protein increased significantly in the hepatocytes ofR. chensinensis. Both ER and VTG expression exhibited BPA dose-dependence for the same exposure time. For the same concentration of BPA treatment, VTG synthesis markedly increased with prolonged treatment, whereas the expression of ER did not significantly fluctuate. It is suggested that BPA caused the synthesis of VTG by inducing ER up-regulation in the hepatocytes of maleR. chensinensis,but its estrogenic activity was much lower than E2.

Bisphenol A; Hepatocytes; Estrogen receptor; Vitellogenin;Rana chensinensis

X174; Q959.53

A

0254-5853-(2011)03-0317-06

10.3724/SP.J.1141.2011.03317

2010-06-29；接受日期：2011-04-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30770243)

?通訊作者(Corresponding author)，E-mail: yu-huizhang@163.com