花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記分離及其多態(tài)性分析

趙 燕, 季相山, 曾勇慶, 丁 雷, 楊萍萍, 王 慧

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山東 泰安 271018)

花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記分離及其多態(tài)性分析

趙 燕, 季相山, 曾勇慶, 丁 雷, 楊萍萍, 王 慧*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院, 山東 泰安 271018)

該文利用FIASCO法(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法開(kāi)發(fā)花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記, 并對(duì)篩選的標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。兩種方法共獲得54條能夠設(shè)計(jì)引物的序列, 擴(kuò)增結(jié)果顯示15對(duì)引物具有多態(tài)性, 多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)為 2～10個(gè)。15個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)中, 4個(gè)位點(diǎn)偏離了Hardy-Weinberg平衡; 各位點(diǎn)間沒(méi)有連鎖不平衡現(xiàn)象; 僅位點(diǎn)SP52可能存在無(wú)效等位基因; 除SP17和SP468外,其余引物的PIC值均在0.5以上, 可用于花鱸群體遺傳分析等研究。

FIASCO法; 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢法; 花鱸; 微衛(wèi)星

微衛(wèi)星具有多態(tài)性豐富、易于快速檢測(cè)等特點(diǎn),在種質(zhì)資源保存利用、遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等方面的研究中發(fā)揮著非常重要的作用, 已經(jīng)發(fā)展成為當(dāng)前主流的分子標(biāo)記之一(Wang et al, 2009)。FIASCO法(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)是基于AFLP技術(shù)的一種非常有效的分離微衛(wèi)星位點(diǎn)的方法(Zane et al, 2002)。它將AFLP與雜交選擇相結(jié)合, 能夠簡(jiǎn)單快速提高陽(yáng)性率, 發(fā)展前景較大, 已經(jīng)在黃鱔(Monopterus albus) (Li et al, 2007)、鱖魚(yú)（Siniperca chuatsi） (Kuang et al, 2009)等多種魚(yú)類微衛(wèi)星的開(kāi)發(fā)上使用。數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法是從公用的DNA 序列數(shù)據(jù)庫(kù)(GenBank、EMBL和DDBJ等)中查找所研究物種的序列信息, 并用于開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)有效的方法(Brown et al, 1996)。

當(dāng)前已開(kāi)發(fā)的花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記較少, 僅 Jiang et al (2007, 2008)發(fā)表了22個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記, 其中有13個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記為混合微衛(wèi)星, 不適于種群遺傳學(xué)研究, 遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了花鱸遺傳育種等研究的需要。在微衛(wèi)星開(kāi)發(fā)的幾種方法中, 從基因組文庫(kù)中篩選,耗時(shí)、費(fèi)力, 效率較低; 從近緣中擴(kuò)增, 成功率較低。本研究選擇目前應(yīng)用較廣泛的FIASCO法構(gòu)建花鱸部分基因組文庫(kù)及參照 GenBank上花鱸的相關(guān)序列設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物兩種方法, 對(duì)花鱸微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行研究, 這可為花鱸群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析、遺傳資源的保護(hù)利用和分子標(biāo)記輔助育種等打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用花鱸活體樣本捕自山東煙臺(tái)近海, 共30個(gè)個(gè)體, 取其尾鰭置于75%酒精中, 保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建與序列測(cè)定

用蛋白酶K消化和酚/氯仿抽提法從花鱸的鰭條中分離、純化基因組DNA (Sambrook & Russell, 2002)。

基因組DNA用限制性內(nèi)切酶MseⅠ酶切后回收250～1 000 bp的片段, 回收產(chǎn)物與接頭oligo-MseⅠA (HO 5'-TACTCAGGACTCAT-3' OH)和oligo-MseⅠB (HO 3'-GAGTCCTGAGTAGCAG-5' OH) 連接。建立17.5 μL連接體系(接頭20 μmol/L, 2.5 μL; T4 DNA ligase 6 U, 10×buffer 1.75 μL, 純化的酶切產(chǎn)物 10 μL), 置16 ℃水浴中過(guò)夜連接。利用預(yù)擴(kuò)引物MseⅠ- N(5'-ATGAGTCCTGAGTAAN-3')對(duì)連接了接頭的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性30 s, 53 ℃退火30 s, 72 ℃延伸 1 min, 共進(jìn)行 30個(gè)循環(huán), 最后 72 ℃延伸10 min?；厥?50～1 000 bp的預(yù)擴(kuò)增片段用于雜交分析。

雜交體系包含生物素標(biāo)記的(GT)13的探針 6.0 μL(40 μmol/L), 雜交液(6×SSC + 0.1% SDS)70 μL,預(yù)擴(kuò)增回收產(chǎn)物 20 μL。磁珠經(jīng) 250 μL的TEN100(10 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, pH 7.5)洗滌3次, 每次5 min后, 將雜交產(chǎn)物和300 μL TEN100加入到預(yù)處理過(guò)的磁珠中, 室溫反應(yīng)30 min。分別用400 μL TEN1000(0.2 ×SSC + 0.1% SDS)和洗脫液(0.2×SSC + 0.1% SDS)各洗滌磁珠3次, 每次5 min, 其間不時(shí)用移液器輕輕吹打, 重懸磁珠。最后用400 μL 1×SSC洗滌磁珠5 min。加50 μL TE, 95 ℃水浴中變性5 min, 洗脫含有微衛(wèi)星序列的單鏈 DNA。以洗脫的含有微衛(wèi)星的單鏈 DNA為模板再次用引物MseI-N 進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增程序同上, 回收 250～1 000 bp的片段。

將回收的目的片段連接到pMD18-T載體中并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α中, 涂平板后挑取單克隆,用引物MseI-N進(jìn)行PCR檢測(cè), 挑選陽(yáng)性克隆送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司測(cè)序。利用DNAMAN Version 4.0 和GenBank中的Blastn軟件對(duì)測(cè)得序列進(jìn)行比對(duì), 去掉冗余序列。

1.3 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索

輸入“Laterolabrax japonicus”作為搜索關(guān)鍵詞,在 NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http: // www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索核苷酸序列, 下載所有相關(guān)序列以 FSATA格式保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 序列分析及微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)

利用 SSRHUNTER 1.3(http://en.bio-soft.net/ dna/SSRHunter.html)軟件, 對(duì)以上兩種方法得到的序列進(jìn)行分析, 含二堿基、三堿基、四堿基重復(fù) 5次以上的為含微衛(wèi)星的序列。根據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列, 利用軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)引物, 并交由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司合成。

1.5 微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性檢測(cè)

利用合成的引物分別在 30個(gè)花鱸個(gè)體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增用于分析其多態(tài)性。PCR反應(yīng)總體積為20μL , 內(nèi)含20 ng的模板DNA, 0.2 μmol/L的引物, 200 μmol/L的dNTPs, 1.5 mmol/L 的Mg2+, 1 X PCR 反應(yīng)緩沖液, 1 U 的Taq DNA 聚合酶。PCR反應(yīng)為 30個(gè)循環(huán), 每個(gè)循環(huán)包括: 94℃變性 30 s,退火30 s, 72 ℃延伸1 min; 首次循環(huán)前預(yù)變性5 min; 最后一次循環(huán)結(jié)束后 72 ℃再延伸 10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 硝酸銀染色后數(shù)碼相機(jī)拍照保存。

1.6 數(shù)據(jù)分析

微衛(wèi)星標(biāo)記呈共顯性, 可直接根據(jù)每個(gè)個(gè)體產(chǎn)生的條帶的位置確定基因型, 利用Popgene32 處理數(shù)據(jù), 計(jì)算多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因數(shù)目、觀測(cè)雜合度(HO)、期望雜合度(HE), 并按下列公式計(jì)算多態(tài)性信息含量(PIC):

其中，Pi和Pj分別為第i和第j個(gè)等位基因的頻率,n為等位基因個(gè)數(shù)。

利用 MICRO-CHECKER Version 2.2.3軟件估計(jì)位點(diǎn)的無(wú)效等位基因頻率。所有多重比較均經(jīng)Bonferroni校正。

2 結(jié) 果

2.1 FIASCO法篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記

從構(gòu)建的文庫(kù)中隨機(jī)挑取150個(gè)克隆, 利用預(yù)擴(kuò)引物進(jìn)行PCR鑒定, 共得到陽(yáng)性克隆94個(gè), 陽(yáng)性率為62.7%; 對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序得到66個(gè)含微衛(wèi)星序列的克隆, 陽(yáng)性序列比例為70.2%。66條微衛(wèi)星序列中共含微衛(wèi)星座位108個(gè), 其中CA/GT重復(fù)序列97個(gè), 占89.8%, GA/CT重復(fù)4個(gè), 占3.7%, 其他重復(fù)序列7個(gè), 占6.5%。在這些含微衛(wèi)星重復(fù)的序列中, 微衛(wèi)星重復(fù)數(shù)在10次以上的, 占70.3%。在這些位點(diǎn)的重復(fù)序列中, 共3個(gè)復(fù)合型(sp52、sp416、sp468), 其他為完美型。利用 DNAMAN 4.0 和GenBank中的Blastn軟件對(duì)這66條微衛(wèi)星序列進(jìn)行比對(duì), 去掉冗余序列后全部提交 GenBank, 并利用 Premier 5.0軟件共設(shè)計(jì)引物42對(duì), 部分微衛(wèi)星序列及引物信息見(jiàn)表1。

2.2 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果

表1 FIASCO法獲得的部分花鱸微衛(wèi)星序列Tab. 1 Microsatellite sequences obtained by FIASCO

截至2010年2月, 在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中共搜索到540條花鱸核苷酸序列及132條EST序列, 經(jīng)SSRHUNTER 1.3軟件分析, 含微衛(wèi)星的序列為22條, 其中8條為基因的全長(zhǎng)cDNA序列; 1條為基因的部分cDNA序列; 13條為EST序列。在22條微衛(wèi)星序列中含微衛(wèi)星座位 29個(gè), 其中CA/GT重復(fù)序列14個(gè), 占48.3%,GA/CT重復(fù)10個(gè), 占34.5%,三堿基重復(fù)序列5個(gè), 占17.2%。在這些含微衛(wèi)星重復(fù)的序列中, 微衛(wèi)星重復(fù)數(shù)在10次以上的僅6個(gè),重復(fù)數(shù)在5～7次間的為22個(gè)(75.8%)。在8條基因的全長(zhǎng) cDNA序列中, 微衛(wèi)星座位多數(shù)位于內(nèi)含子、3′-UTR、5′-UTR等區(qū)域, 僅有1個(gè)位于外顯子區(qū)域(表2)。

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性分析

兩種方法篩選的微衛(wèi)星序列共設(shè)計(jì)引物54對(duì),利用8尾花鱸的DNA對(duì)各引物擴(kuò)增情況作初步篩選, 發(fā)現(xiàn)32對(duì)能擴(kuò)增出與期望PCR產(chǎn)物大小相等或相近的片段, 其中 15對(duì)引物的擴(kuò)增片段有穩(wěn)定的多態(tài)性(表3), 其余的都為單態(tài)。應(yīng)用這15對(duì)引物對(duì)30個(gè)個(gè)體進(jìn)行了PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定, 其中微衛(wèi)星引物SPd10擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見(jiàn)圖1。

表2 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)查詢得到的部分微衛(wèi)星序列Tab. 2 Microsatellite sequences obtained by bioinformatic screening in GenBank

在野生花鱸30個(gè)個(gè)體中, 15個(gè)花鱸多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到89個(gè)等位基因, 平均每個(gè)位點(diǎn)5.9個(gè)等位基因, 表現(xiàn)出高度多態(tài)性, 各等位基因大小在141～349之間(表3)。Popgene32 分析結(jié)果顯示, 15個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度在0.6000～序的微衛(wèi)星序列中, CA/GT重復(fù)序列97個(gè), 占1.0000之間, 期望雜合度在 0.5079～0.8890之間。經(jīng)Bonferroni 校正后(P＜ 0.003), 各位點(diǎn)間沒(méi)有連鎖不平衡現(xiàn)象, 4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(SP17、SP52、 SP94 和SP468)偏離了 Hardy-Weinberg平衡。MICROCHECKER 2.2.3軟件分析表明僅位點(diǎn)SP52可能存在無(wú)效等位基因。同時(shí), 對(duì) 15對(duì)微衛(wèi)星引物的多態(tài)性信息含量(PIC)進(jìn)行了評(píng)估, SP17位點(diǎn)提供的信息含量為 0.4189; SP468為 0.3747, 其余引物的PIC值均在0.5以上, 可用于花鱸群體遺傳分析等研究。

圖1 微衛(wèi)星標(biāo)記SPd10在花鱸30個(gè)個(gè)體中的擴(kuò)增圖譜Fig. 1 Amplification results of microsatellite locus SPd10 in 30 Lateolabrax japonicus individuals

表3 15個(gè)多態(tài)性花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記分析結(jié)果Tab. 3 Characteristics of 15 polymorphic microsatellite markers in Lateolabrax japonicus

3 討 論

目前開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記的方法很多, 概括起來(lái)有3種: (1)從基因組文庫(kù)中篩選微衛(wèi)星; (2)從數(shù)據(jù)庫(kù)或有關(guān)文章中查詢; (3)從近緣物種中篩選微衛(wèi)星(Zhan et al, 2008)。本文研究發(fā)現(xiàn), 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索法得到的花鱸微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)率為 41.7%, 多態(tài)性較高。其他的研究也得到類似的結(jié)果, 如Ji et al(2009)搜索 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的牙鲆(Paralichthys olivaceus)全cDNA序列, 得到15個(gè)具有高多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn), 多態(tài)率為 46.8%; Furukawa et al (2004)用同樣的方法搜索到11個(gè)具有多態(tài)性的河豚微衛(wèi)星位點(diǎn), 多態(tài)率為73%。從數(shù)據(jù)庫(kù)中查找微衛(wèi)星位點(diǎn), 雖然省時(shí)省力, 但受限于數(shù)據(jù)庫(kù)中提交序列的數(shù)量, 多數(shù)物種因提交的序列較少只能開(kāi)發(fā)出有限的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記。FIASCO法是Zane et al (2002)年提出的一種高效的篩選微衛(wèi)星標(biāo)記的方法。此法一經(jīng)提出, 便被迅速?gòu)V泛地應(yīng)用于許多物種的微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選(Reed et al, 2001)。本文利用FIASCO法構(gòu)建了花鱸(GT)13的微衛(wèi)星富集文庫(kù),在所有測(cè)序的微衛(wèi)星序列中，CA/GT重復(fù)序列 97個(gè)，占89.8%。而通過(guò)傳統(tǒng)的篩選小插入片段基因文庫(kù)的方法分離微衛(wèi)星標(biāo)記, 得到的陽(yáng)性克隆比例極低(0.1%～6.4%, 平均1.96%) (Zane et al., 2002)。

雖然微衛(wèi)星可分布于基因組的任何地方, 但是在真核生物中, 微衛(wèi)星位于非編碼區(qū)的頻率遠(yuǎn)高于位于編碼區(qū)的(Toth et al, 2000)。本文研究發(fā)現(xiàn), 在花鱸8條基因的全長(zhǎng)cDNA序列中, 微衛(wèi)星座位多數(shù)位于內(nèi)含子、3'-UTR、5'-UTR等區(qū)域, 僅有1個(gè)位于外顯子區(qū)域, 占 12.5%, 這與其它脊椎動(dòng)物中微衛(wèi)星在外顯子區(qū)的分布頻率(9%～15%)(Moran et al, 1993; Jurka et al, 1995)基本一致。這種微衛(wèi)星位點(diǎn)在編碼區(qū)的低頻現(xiàn)象可能是為了防止蛋白質(zhì)翻譯時(shí)發(fā)生移碼突變的一種保護(hù)機(jī)制(Metzgar et al, 2000; Li et al, 2007)。

本研究得到的15個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中有4個(gè)(SP17、SP52、SP94和SP468)偏離了Hardy-Weinberg平衡。偏離HWE的原因有很多, 例如, 無(wú)效等位基因、檢測(cè)個(gè)體不具有代表性、交配群體等。軟件分析表明, 僅位點(diǎn)SP52可能存在無(wú)效等位基因, 造成其他3個(gè)位點(diǎn)偏離HWE的原因可能是檢測(cè)個(gè)體數(shù)目過(guò)小, 檢測(cè)的個(gè)體不具代表性等所致。

微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性一般用3個(gè)指標(biāo)評(píng)價(jià): 等位基因的數(shù)目、雜合度和多態(tài)性信息含量值(PIC)。其中等位基因數(shù)目和雜合度能較好地反映群體中等位基因的豐富程度和均勻程度, 而多態(tài)性信息含量值反映了微衛(wèi)星位點(diǎn)能夠提供的遺傳信息容量。本研究得到的花鱸 15個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到 89個(gè)等位基因, 平均每個(gè)位點(diǎn) 5.9個(gè)等位基因,表現(xiàn)出高度多態(tài)性, 且 15個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度在 0.6000～1.0000之間, 期望雜合度在0.5079～0.8890之間; 而Jiang et al(2007)對(duì)22個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性分析顯示, 其觀測(cè)雜合度在0.114～0.914之間, 期望雜合度在0.111～0.938之間,這表明花鱸野生群體具有較高的遺傳多樣性。據(jù)Gu et al (2008), 當(dāng)PIC＞0.5 時(shí), 表明該遺傳標(biāo)記可提供豐富的遺傳信息。本文研究結(jié)果表明, 15個(gè)花鱸多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)中的13個(gè)位點(diǎn)PIC值均大于0.5, 說(shuō)明本文新開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星位點(diǎn)提供的遺傳信息容量大,能為群體遺傳性分析提供有力的工具。

本文利用 FIASCO法和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢法兩種方法開(kāi)發(fā)了花鱸微衛(wèi)星位點(diǎn) 15個(gè), 并對(duì)其多態(tài)性進(jìn)行了研究, 結(jié)果表明數(shù)據(jù)庫(kù)查詢法簡(jiǎn)便快捷, 多態(tài)性好; FIASCO法富集效率高, 適合用于花鱸微衛(wèi)星標(biāo)記大規(guī)模的開(kāi)發(fā)。開(kāi)發(fā)的多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記可為花鱸群體遺傳學(xué)研究、連鎖圖譜構(gòu)建等提供有力的支持。

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Isolation of microsatellite markers forLateolabrax japonicusand polymorphic analysis

ZHAO Yan, JI Xiang-Shan, ZENG Yong-Qing, DING Lei, YANG Ping-Ping, WANG Hui*

(College of Animal Science and Technology,Shandong Agriculture University,Taian271018,China)

To investigate population structure and marker assisted breeding, fast isolation by AFLP of sequences containing repeats (FIASCO) and GenBank database mining were used to develop novel microsatellite markers for sea perch (Lateolabrax japonicus). Genomic DNA fragments containing SSR sequences were captured by hybridization to (GT)13biotin-labeled probe and were ligated to PMD18-T vector. Among 150 randomly chosen clones from the SSR-enriched library, 66 sequences contained microsatellite motif over five repeats. In addition, 540 cDNA sequences and 132 ESTs ofLateolabrax japonicuswere downloaded from GenBank and screened for di-, tri- and tetra-nucleotide repeats, while 22 sequences were found to contain microsatellites. As a result, 15 microsatellite loci were shown to be polymorphic in 30Lateolabrax japonicusindividuals, with the alleles ranging from two to ten, the observed heterozygosities from 0.6000 - 1.0000, and the expected heterozygosities from 0.5079 - 0.8890. Four loci (SP17, SP52, SP94 and SP468) were deviated from HWE in the sampled population after Bonferroni’s correction, and no linkage disequilibrium was found among all loci (P＜0.003), whereas null alleles were detected at locus SP52 (P＜0.05). Among 15 polymorphic loci, the PIC values, which can be used for related population genetics analysis, were all above 0.5, with the exception of SP17 and SP468.

FIASCO; Database mining;Lateolabrax japonicus; Microsatellite

Q95-33; Q959.483

A

0254-5853-(2011)05-0515-06

10.3724/SP.J.1141.2011.05515

2011-02-21; 接受日期: 2011-07-08

國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA101010); 國(guó)家發(fā)改委生物育種高技術(shù)專項(xiàng)(2007249051); 山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大項(xiàng)目(2007LZ013); 博士后創(chuàng)新基金項(xiàng)目(200703044)

?通訊作者(Corresponding author)，王慧(1963 - ), 女, 教授, 博導(dǎo),Tel: 13001771684; E-mail: wanghui2328@sdau.edu.cn