PGE2 受體EP2 和EP4 調節(jié)CIA 小鼠脾B 細胞表面分子和細胞因子表達*

張敬各， 陳海英， 秦 瑾，， 叢 斌△， 李巧霞， 賈嫻嫻， 馬春玲， 于 峰

(1 河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，河北省法醫(yī)學實驗室，河北 石家莊050017;2 河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院，河北 石家莊050051)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關節(jié)炎癥細胞浸潤，滑膜細胞增生，以及軟骨和骨組織損害為特征的慢性自身免疫性疾病。其發(fā)病過程涉及多種因素，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)是人體內含量最多的一種前列腺素［1］，且是一種重要的炎癥介質。目前廣泛用于治療RA 的非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti－inflammatory drugs，NSAID)正是通過抑制環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)從而抑制前列腺素(主要是PGE2)的產生而達到緩解癥狀的目的。PGE2通過與細胞膜上相應受體(E－prostanoid，EP)結合而發(fā)揮作用。已確定的EP 有4種亞型，即EP1、EP2、EP3 和EP4［2］，它們廣泛分布于機體各種組織和細胞中，通過與特定的G 蛋白偶聯(lián)而介導不同的生物學效應。實驗證明，單獨敲除或抑制某一種EP 并不影響膠原誘導性關節(jié)炎(collagen－induced arthritis，CIA)小鼠的發(fā)病程度，而同時抑制EP2 和EP4 顯著降低CIA 關節(jié)炎評分，提示PGE2的關節(jié)炎效應主要由EP2 和EP4 介導［3，4］。其它大量實驗也證實了兩者在RA 發(fā)病中的重要作用［5－8］。

目前認為，B 細胞在RA 的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用。Edwards 等［9］將治療B 細胞淋巴瘤的藥物rituximab(利妥昔單抗，一種清除B 細胞的抗體)用于RA 治療的成功，進一步也證明了可以將B 細胞作為治療自身免疫病的靶點。本實驗采用CIA 小鼠模型，通過觀察EP2 和EP4 阻斷劑處理CIA 小鼠后，小鼠脾B 細胞表面分子和細胞因子表達的變化，探討PGE2及其受體EP2/EP4 在RA 發(fā)病機制中的作用，為指導臨床正確應用NSAID，尋找更精確的抗炎藥物作用靶點提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 主要試劑 不完全弗氏佐劑和雞Ⅱ型膠原(collagen type Ⅱ，col Ⅱ)購自Sigma，EP2 阻斷劑AH6809 購自Cayman，EP4 阻斷劑L161982 購自Tocris，卡介苗購自中國藥品生物制品檢定所，CD19+免疫磁珠購自美天旎公司，Trizol 購自Invitrogen，PrimeScriptTMRT reagent Kit 購自大連寶生物公司，Power SYBR Green PCR Master Mix 購自Applied Biosystems，流式抗體購自eBioscience。

1.2 動物 健康DBA/1 小鼠，6－8 周齡，由上海斯萊克實驗動物中心提供，實驗動物證書號為SCXK(滬)200720005。

2 方法

2.1 CIA 小鼠模型建立和分組 選用健康的DBA/1 小鼠36 只，隨機分為空白對照組(6 只)和CIA 單純造模組(12 只)，AH6809(EP2 阻斷劑)處理組(9只)，L161982(EP4 阻斷劑)處理組(9 只)。適應環(huán)境3 d 后給小鼠尾根部皮內注射雞Col Ⅱ200 μg及完全弗氏佐劑的乳化劑(其內含有200 μg 結核分枝桿菌H37Ra)100 μL，第21 d 再次免疫增強。AH68095 和L161982 處理組分別給予相應的藥物，劑量均為5 mg·kg－1·d－1，腹腔注射100 μL，從第2 次Col Ⅱ免疫后第2 d 開始，連續(xù)14 d。

2.2 小鼠脾B 細胞制備 脫頸處死小鼠，無菌摘取脾臟，置于200 目不銹鋼篩網上，注射器針芯輕輕研磨，加入PBS 沖洗得到脾細胞懸液。取脾細胞用CD19+免疫磁珠分選B 細胞，流式細胞儀檢測細胞純度在95%以上。

2.3 B 細胞EPs 檢測 根據(jù)Trizol 說明提取細胞總RNA，測定RNA 純度和濃度。取0.5 μg 總RNA 經37 ℃15 min，85 ℃5 s 反轉錄成cDNA，以cDNA 為模板，在ABI 7500 real－time PCR 儀上進行實時熒光定量PCR 反應。反應條件:95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環(huán)。引物由上海生物技術工程公司合成。EP1 上游引物5’－ CCACTGGGGACGAGTACAGT－3’，下 游 引 物5’－ AGGTCAAGATGGGAACATGC－3’;EP2 上游引物5’－CTGGTAACGGAATTGGTGCT－3’，下 游 引 物5’－CAGGGAACAGAAGAGCAAGG－3’;EP3 上游引物5’－ CTCCAGCCTCAGAACCTTTG－3’，下游引物5’－GAAATGATGGCACGATTCCT－3’;EP4 上游引物5’－TCTCTGGTGGTGCTCATCTG－3’，下游引物5’－ACGTGCTGCTGATCTCCTTT’;β－actin 上游引物5’－TACCCAGGCATTGCTGACAGG－3’，下游引物5’－ACTTGCGGTGCACGATGGA－3’。PCR 擴增產物用2 %瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。

2.4 小鼠B 細胞CD80、CD86 和MHC Ⅱ表達 分選小鼠脾B 細胞，調整細胞密度為1 ×106cells/100 μL，分別加入FITC－抗CD80、FITC－抗CD86 或FITC－抗MHCⅡ抗體，4 ℃避光孵育30 min，PBS 洗滌2 次，用流式細胞儀進行檢測。每次實驗用同型抗體作對照，用平均熒光強度(mean fluorescence intensity，MFI)表示CD80、CD86 和MHCⅡ蛋白表達量。

2.5 小鼠B 細胞內細胞因子mRNA 表達 取CIA小鼠脾B 細胞cDNA，用實時熒光定量PCR 技術檢測細胞因子的表達。IFN－γ 上游引物5'－AGCAACAACATAAGCGTCAT－3'，下 游 引 物5'－CCTCAAACTTGGCAATACTC－3';TNF－α 上游引物5'－CTGTGAAGGGAATGGGTGTT－3'，下游引物5'－CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC－3';IL－10 上游引物5'－ACCAAAGCCACAAAGCAG－3'，下游引物5'－GGAGTCGGTTAGCAGTATG－3';IL－6 上游引物5'－TTCTTGGGACTGATGCTG－3'，下游引物5'－CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT－3';IL－4 上 游 引 物5'－TC CTGCTCTTCTTTCTCG－3'，下游引物5'－TTCTCCTGTGACCTCGTT－3';TGF－β 上游引物:5'－ATGGTGGACCGCAACAAC－3'，下游引物5'－AGCCACTCAGGCGTATCAG－3'。以β－actin 為內參照，序列同2.3。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 CIA 小鼠病變的形態(tài)學觀察及關節(jié)炎評分

小鼠于第1 次免疫后第27 d 足趾關節(jié)開始出現(xiàn)腫脹，首先是兩后足出現(xiàn)紅腫，以后延伸到前足和尾部并日趨嚴重，第35 d 左右達到高峰，見圖1、2，提示CIA 小鼠模型建立成功。

Figure 1. Typical pattern of CIA in DBA/1 mice with the change of paw. A:normal paw;B:CIA paw.圖1 CIA 小鼠足爪

Figure 2. Typical pattern of CIA in DBA/1 mice with the change of arthritic scores.圖2 CIA 小鼠關節(jié)炎評分

2 EPs 在B 細胞上的表達

實時熒光定量RT－PCR 技術檢測到PGE2受體的4 個亞型EP1、EP2、EP3、EP4 mRNA 在DBA 小鼠脾B 細胞上均有不同程度的表達。其中，EP2 表達最強，然后依次是EP1 和EP3，EP4 表達最弱，見圖3、4。

Figure 3. Gene expression of EP receptors in mouse B－cells.Total RNA was subjected to real－time PCR with primers specific for EP1，EP2，EP3 and EP4. Results are shown as an amplification plot for each EP receptor.圖3 熒光定量PCR 檢測的小鼠B 細胞上EPs 的熔解曲線

Figure 4. The mRNA expression of EPs in mouse B－cells detected by gel electrophoretogram. M:marker (100 bp ladder). The amplification products of EP1，EP2，EP3，EP4 and β－actin were approximately 329，303，319，343 and 218 bp，respectively.圖4 EPs 在正常小鼠B 細胞上的表達

3 CIA 模型中EP2/EP4 表達的變化

實時熒光定量PCR 結果顯示，CIA 模型小鼠脾B 細胞EP2/EP4 表達均明顯增多，分別增多了9.72和4.87 倍，見圖5。

Figure 5. The mRNA expression of EP2/EP4 in B－cells in normal group and CIA group analyzed by real－time PCR. ±s. ＊＊P ＜0.01 vs normal group.圖5 CIA 模型組小鼠B 細胞EP2/EP4 表達增加

4 小鼠脾B 細胞CD80、CD86 和MHCⅡ表達的變化

流式細胞儀檢測結果顯示，CIA 小鼠脾B 細胞CD80、CD86 和MHCⅡ表達均增加。與CIA 模型組相比，AH6809 處理組CD80、CD86 和MHCⅡ的表達均降低(P ＜0.05)，L161982 處理組CD86 和MHCⅡ的表達減少(P ＜0.05)。這表明EP2 阻斷劑能夠不同程度地抑制CD80、CD86 和MHCⅡ的表達，而EP4阻斷劑對CD86 和MHCⅡ的表達具有抑制作用，對CD80 的作用不明顯，見圖6。

Figure 6. FCM analysis of the expression of CD80，CD86 and MHC Ⅱin B－cells. ±s. #P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group;* P＜0.05 vs CIA group.圖6 流式細胞儀檢測小鼠B 細胞CD80、CD86 和MHC Ⅱ表達的變化

5 小鼠脾B 細胞內細胞因子表達的變化

結果顯示，CIA 模型組小鼠IFN－γ 表達增加，IL－4 表達降低(P ＜0.05)，TNF－α 和IL－6 表達明顯增高(P ＜0.01)，TGF－β 和IL－10 的表達與正常組相比沒有明顯差異;EP2 阻斷劑AH6809 可以降低IFN－γ 的表達水平(P ＜0.05)，促進IL－4 和IL－10 的表達(P ＜0.01)，抑制TNF－α 和IL－6 表達的增加(P ＜0.01);EP4 阻斷劑L161982 可以抑制IFN－γ、TNF－α 和IL－6 表達的增加(P ＜0.05 和P ＜0.01)，提高TGF－β 和IL－10 的表達水平(P ＜0.01 和P ＜0.05)，見圖7。

Figure 7. The expression of cytokines in B cells analyzed by real－time PCR. ± s. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CIA group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group.圖7 不同處理組B 細胞內細胞因子的表達變化

討 論

大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗CD20 單克隆抗體(rituximab)通過選擇性去除B 細胞，對難治性RA 患者具有很好的治療作用，但同時也發(fā)現(xiàn)許多治療患者血清自身抗體并未減低，使人們逐漸意識到B 細胞促進疾病發(fā)生可能并不完全依賴抗體形成，而其抗原提呈、細胞因子生成及激活T 細胞的功能在許多炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用［10］。

PGE2作為重要的介質之一，在RA 發(fā)病過程中起著重要的病理生理作用。PGE2與受體結合是PGE2發(fā)揮作用的前提，因此，我們首先檢測了小鼠B細胞上EPs 的表達情況，EPs 在B 細胞上的存在及在CIA 模型中EP2/EP4 表達的增加均為PGE2通過B 細胞發(fā)揮免疫調節(jié)作用提供了直接的結構基礎，也為其受體阻斷劑可以通過與B 細胞作用影響免疫調節(jié)功能提供了理論依據(jù)。

在免疫應答過程中，T 細胞的激活需雙信號的刺激，第一信號為抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)表面MHC－Ag 復合物分子與T 細胞特異性受體結合，第二信號為APC 表面共刺激分子與T細胞相應的配體結合。兩種信號協(xié)調刺激作用后才可激活T 細胞，參與免疫殺傷效應以及細胞免疫過程。本實驗檢測了B 細胞表面抗原提呈相關分子MHCⅡ和共刺激分子CD80/CD86 的表達情況，結果顯示，CIA 模型小鼠脾B 細胞MHCⅡ和CD80/CD86表達均明顯增多，說明B 細胞的抗原提呈功能明顯增強。EP2/EP4 阻斷劑通過不同程度地抑制CIA 小鼠B 細胞MHCⅡ和CD80/CD86 的表達可以抑制B細胞與活化T 細胞的反應，從而可能達到改善RA 癥狀的目的。

細胞因子網絡和細胞因子失衡在自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用，在RA 的病程中，細胞因子對炎癥的調控具有重要地位［11］。IFN－γ 有廣泛的免疫調節(jié)作用，能活化NK 細胞，提高其殺傷能力;誘導巨噬細胞和B 細胞表達MHCⅡ類分子，提高其抗原提呈能力。而IL－4 能抑制IFN－γ 的分泌，維持Th2 的增殖，拮抗IFN－γ 的前炎癥效應并抑制Th1細胞的增生［12］，對軟骨和骨的破壞具有保護作用。TNF－α 可上調單核巨噬細胞MMP－9 表達及活化，增強炎癥細胞的侵蝕力，可能在RA 關節(jié)破壞機制中起著重要的作用［13］;抑制TNF－α 可以阻止RA 的發(fā)生，用阻斷TNF－α 活性的藥物可以改善RA 臨床癥狀［14］。IL－6 是B 細胞分化因子，與RA 患者的骨和軟骨破壞及骨質疏松有關。干預IL－6 活性也是一種RA 治療途徑［15］。B 細胞分泌的IL－10 既可以通過調節(jié)Th1/Th2 平衡抑制免疫病理反應，又可以直接消弱免疫細胞介導的炎癥反應［16］。臨床上已經將IL－10 作為一種生物制劑用于RA 的治療。而TGF－β 既可以誘導Treg 細胞分化，下調免疫應答，又可以抑制Th1 細胞功能，促進Th17 分化［17］。

研究表明，PGE2可通過EP2/EP4 信號和cAMP途徑抑制CD4+T 細胞IL－10 生成［5］，促進IFN－γ和IL－17 生成促進免疫炎癥反應［5，6］;又可抑制巨噬細胞TNF－α 表達，促進IL－6 生成發(fā)揮抗炎作用［7］。PGE2究竟發(fā)揮促炎作用還是抗炎作用依賴于不同的疾病和模型、不同的受體亞型、不同的細胞及其不同的微環(huán)境等而異。本實驗中，CIA 模型組小鼠B 細胞IFN－γ 表達增加，IL－4 表達降低，TNF－α 和IL－6 表達明顯增高。EP2 阻斷劑可以降低IFN－γ、TNF－α 和IL－6 的表達水平，而促進IL－4和IL－10 的表達;EP4 阻斷劑可以抑制IFN－γ、TNF－α 和IL－6 的表達水平，而促進TGF－β 和IL－10的表達。表明PGE2受體EP2 和EP4 介導了CIA 小鼠B 細胞內細胞因子的生成，發(fā)揮了促炎作用，推測PGE2通過調節(jié)EP2/EP4 受體途徑有可能改善關節(jié)炎的癥狀。

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