抑癌基因DPC4和TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中的表達和意義

陜 光 唐 甜

抑癌基因DPC4和TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中的表達和意義

陜 光 唐 甜1＊

（武漢大學人民醫(yī)院泌尿Ⅱ科；1武漢大學人民醫(yī)院腫瘤Ⅱ科 湖北430060）

目的 探討膀胱尿路上皮癌中TGF-β1和DPC4的表達及其意義。方法 收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2000-2006年有完整臨床和病理資料的膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例和5例癌旁組織，采用免疫組織化學S-P法檢測50例膀胱尿路上皮癌和5例癌旁組織中DPC4和TGF-β1的表達水平。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)，對DPC4和TGF-β1的表達進行定量分析，并用SPSS13.0軟件對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率做單因素方差分析和SNK（q）檢驗。結果 （1）TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中呈高表達，癌旁組織中呈低表達。膀胱尿路上皮癌與癌旁組織相比，差異有顯著性 （P＜0.05）；（2）DPC4在膀胱尿路上皮癌中呈低表達，癌旁組織中呈高表達。膀胱尿路上皮癌與癌旁組織相比，差異有顯著性 （P＜0.05）。結論 TGF-β1高表達和DPC4低表達可能促進腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

膀胱尿路上皮癌；DPC4；TGF-β1；免疫組織化學

膀胱癌在男性惡性腫瘤中位居第4位，女性惡性腫瘤中位居第8位［1］。膀胱癌發(fā)病率及死亡率近年來均呈現(xiàn)上升趨勢，可能與吸煙、職業(yè)、大氣污染及飲食結構的改變等有關，但確切病因還有待進一步探索。

轉化生長因子β（Transforming growth factorβ，TGF-β）超家族成員是在發(fā)育和組織內環(huán)境穩(wěn)定中起中樞作用的多功能生長因子［2］，具有調節(jié)細胞生長、死亡或凋亡、細胞分化和細胞外基質合成等不同的生物學功能。TGF-β被認為是病理狀態(tài)下細胞外基質積聚導致組織纖維化的關鍵調節(jié)因子［3］。

TGF-β最顯著的生物學效應是對上皮細胞的生長抑制，此外還包括對分化與凋亡的誘導及對遺傳物質穩(wěn)定性的維持。當腫瘤細胞喪失對TGF-β生長抑制的敏感性，過多產(chǎn)生的TGF-β可能作用于腫瘤細胞和基質細胞，產(chǎn)生侵潤和轉移，誘導血管的生成，抑制抗腫瘤免疫反應［4］。DPC4基因在TGF-β信號通路中編碼一個關鍵的細胞內信使，可以假設：DPC4基因的缺失在腫瘤的發(fā)展中解除了TGF-β信號途徑的生長抑制效應。

DPC4基因的主要功能是作為序列保守的SMADs蛋白家族中的一員，參與轉化生長因子TGF-β超家族在細胞內的信號傳導，在TGF-β超家族的信號傳導途徑中處于中樞地位。研究表明，DPC4以缺失與失活和某些腫瘤的發(fā)生與發(fā)展具有密切的聯(lián)系［5］。

我們通過免疫組織化學方法試圖探討二者與膀胱移行細胞癌的關系，以期能進一步闡明膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機理，尋找早期預測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學標記物，為膀胱癌的發(fā)生和復發(fā)的預測提供一定的參考依據(jù)。

材料和方法

1.材料

收集武漢大學人民醫(yī)院病理科2004-2006年膀胱尿路上皮癌存檔蠟塊50例（均經(jīng)病理學證實為膀胱尿路上皮癌），其中男性38例，女性12例，平均年齡50.3歲，另5例癌旁組織距瘤緣3-5cm。標本均經(jīng)HE染色，光鏡觀察診斷，按WHO尿路腫瘤組織學分類（2004），浸潤性尿路上皮癌30例，非浸潤性乳頭狀尿路上皮癌；高級別15例，低級別5例；按UICC臨床分期，T1 31 例，T2 11 例，T3-4 8例。其中未經(jīng)化療的初發(fā)腫瘤28例，化療后復發(fā)腫瘤22例。

2.方法

HE染色 常規(guī)取材、固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色及封片

3.主要試劑

3.1 即用型兔抗人TGF-β1多克隆抗體；（北京中杉生物技術有限公司）；

3.2 即用型兔抗人DPC4多克隆抗體；（北京中杉生物技術有限公司）；

3.3 超敏即用型SP通用型免疫組織化學試劑盒；（北京中杉生物技術有限公司）；

3.4 DAB顯色試盒及多聚賴氨酸（北京中杉生物技術有限公司）

4免疫組織化學SP法檢測TGF-β1和DPC4相關抗原

具體步驟：5μm組織切片常規(guī)脫蠟至水后，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；抗原修復，室溫自然冷卻后，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗5×3 min；滴加3%過氧化氫，37℃濕盒孵育10min以抑制內源性過氧化物酶活性，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×3min；正常羊血清37℃濕盒孵育10min以減少非特異性背景；甩去多余血清，分別滴加一抗，4℃孵育過夜，0.01MPBS（pH 7.4）漂洗3×5min；滴加生物素標記的二抗37℃濕盒孵育10min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物復合物37℃濕盒孵育10min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗3×3min；滴加新鮮配置的DAB顯色液顯色，光鏡下控制反應時間（約3-5min），自來水沖洗終止反應；蘇木素復染，流水沖洗，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，0.1%氨水返藍；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片并鏡檢；用PBS代替一抗作為陰性對照組，購買的陽性片作為TGF-β1和DPC4的陽性對照組。

5.免疫組織化學結果判斷

5.1 TGF-β1和DPC4以細胞核或胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應，陰性對照組除細胞核染成藍色外，應無棕黃色反應物。

5.2 采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告管理系統(tǒng)（同濟千屏影像公司）對TGF-β1和DPC4的表達進行定量分析，每張切片隨機選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），測定每個視野下陽性反應的平均光密度、陽性反應面積和所有細胞總面積，計算陽性面積率。以每例5個視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。（陽性面積率＝單位面積中陽性反應的總面積／單位面積中細胞的總面積×100%）

6.統(tǒng)計學處理

對各組免疫組織化學反應陽性顆粒的平均光密度、陽性面積率作單因素方差分析和q檢驗，檢驗水準α為0.05。

結 果

1.TGF-β1的表達

膀胱尿路上皮癌細胞內可見較多棕黃色顆粒，TGF-β1呈陽性表達（圖1）；癌旁組織胞核內可見少量的棕黃色顆粒，TGF-β1表達弱，呈陰性表達（圖2）。圖像分析結果見表1。經(jīng)q檢驗，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，TGF-β1的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05），（表1）。

2.DPC4的表達

膀胱尿路上皮癌細胞中可見少量的棕黃色顆粒，DPC4表達弱（圖3）；癌旁組織中可見密集分布的棕黃色顆粒，DPC4呈陽性表達（圖4）。圖像分析結果見表2。經(jīng)q檢驗，膀胱尿路上皮癌與癌旁組織之間，DPC4的平均光密度及陽性面積率有顯著性差異（P＜0.05）（表2）。

表1 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織TGF-β1表達的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 1 The average optical density and the rate of positive area of TGF-β1in SBladder Urothelial Cancer and cancer side tissue（ˉx±s）

表2 膀胱尿路上皮癌和癌旁組織DPC4表達的平均光密度和陽性面積率（ˉx±s）Table 2 The average optical density and the rate of positive area of DPC4in bladder urothelial cancer and cancer side tissue（ˉx±s）

討 論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，目前發(fā)病率呈上升趨勢，且復發(fā)率高，易產(chǎn)生獲得性耐藥。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，初發(fā)時80%為淺表性，其中70%術后復發(fā)，復發(fā)者30%向高級高期發(fā)展，15%-30%的患者初發(fā)時即具有侵襲性，即使經(jīng)過治療，也較早轉移［6］。因此，研究與膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學機理，尋找早期預測膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學標記物，為膀胱癌的發(fā)生和復發(fā)的預測提供一定的參考依據(jù)具有重要的臨床意義。

轉化生長因子β（TGF-β）是一簇屬結構相關的異二聚體多肽，他能夠調節(jié)細胞增殖、分化、形態(tài)形成、凋亡等病理過程及刺激細胞外基質分泌，抑制免疫反應等［7-9］，TGF-β信號轉導通路的異常與腫瘤關系密切 .該通路的異常常見于一些來源于上皮細胞腫瘤發(fā)展的晚期，并且常與腫瘤的侵襲及轉移有關.其中TGF-β1是這一家族的主要成員 .TGF-β信號可抑制B細胞Ig的合成，TGF-β1在腫瘤細胞中過表達能夠破壞宿主T細胞介導的細胞毒性作用，并引起CTL（cytolyic T cell）反應，縱容了腫瘤的進一步發(fā)展［10-12］。

目前認為，TGF-β1在腫瘤的發(fā)展中扮演了雙重角色，早期當細胞對TGF-β1的抗增殖效應仍有反應時，TGF-β1起著腫瘤抑制作用；而在惡性演進期，當細胞獲得了對TGF-β1生長抑制作用的耐受性時，腫瘤細胞可自分泌大量的TGF-β1，通過改變腫瘤組織的微環(huán)境，如誘導腫瘤血管生成，提高腫瘤細胞的運動能力，免疫抑制及胞外基質的合成等來促進腫瘤的發(fā)展及轉移［13-15］。

TGF-β信號轉導途徑是機體內抑制細胞生長、增殖和分化的有效途徑，但在許多研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞對TGF-β失去反應而逃避TGF-β信號轉導途徑的生長抑制作用，這種反應的丟失不僅與TβR-Ⅱ，Smad 2等信號分子的失活有關，而且與DPC4的變異密切相關［16-17］。

抑癌基因DPC4是一種腫瘤抑制基因。其所編碼的Smad4蛋白是轉導TGF-β1信號的重要胞質內信號級聯(lián)分子，調節(jié) TGF-β1應答基因的轉錄.Smad4功能失活或表達低下影響TGF-β1的信號轉導并參與腫瘤的形成［12］。相關報道研究發(fā)現(xiàn)Smad4在多種腫瘤如膽囊癌、口腔鱗癌、膀胱癌等表達下調，并可調控T G F-β細胞信號傳導通路，抑制腫瘤細胞生長［18-20］。

我們采用免疫組織化學的方法，對膀胱尿路上皮癌組織中TGF-β1和DPC4的表達進行檢測，旨在探討他們與膀胱尿路上皮癌發(fā)生發(fā)展的關系。結果表明：TGF-β1在膀胱尿路上皮癌中呈高表達，癌旁組織中呈低表達。而DPC4在膀胱尿路上皮癌中呈低表達，癌旁組織中呈高表達。提示：DPC4基因的缺失或突變阻斷了TGF-β1抑制腫瘤生長的轉導通路，而這種阻斷作用又可能通過負反饋作用使腫瘤細胞自分泌TGF-β1增加，二者可能共同調節(jié)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展及生物學行為。

TGF-β1和DPC4是TGF-β轉導通路中起重要作用的關鍵因子，TGF-β1高表達和DPC4低表達可作為膀胱尿路上皮癌預后不良的指標。同時DPC4在TGF-β1信號轉導中具有關鍵作用，其缺失或突變可使細胞對TGF-β1的生長抑制產(chǎn)生耐受，促進腫瘤的發(fā)展。

DPC4在膀胱尿路上皮癌中的低表達也說明TGF-β1抑制腫瘤生長的轉導通路被阻斷，這種阻斷作用在轉錄過程中以及顯現(xiàn)。這種阻斷作用可能同時還是TGF-β1在腫瘤中高表達的原因。由于膀胱尿路上皮癌組織細胞失去了對TGF-β1的敏感性，導致TGF-β1的反饋性表達升高，而升高的TGF-β1表達失去抑制腫瘤生長的作用，卻沒有喪失對NK，LAK等免疫細胞的抑制作用，因此TGF-β1高表達和DPC4低表達可能促進腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸。其確切機制有待進一步探討。

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圖 版 說 明

圖1 TGF-β1的表達：膀胱尿路上皮癌組 細胞核和胞漿內可見較多棕黃色顆粒，TGF-β1呈陽性表達（?）。SP×200

圖2 TGF-β1的表達：癌旁組織 細胞核和胞漿內可見少量的棕黃色顆粒，TGF-β1呈陰性表達（?）。SP×200

圖3 DPC4的表達：膀胱尿路上皮癌組 細胞核和胞漿內可見少量的棕黃色顆粒，DPC4呈陰性表達（?）。SP×200

圖4 DPC4的表達：癌旁組織 細胞核和胞漿內可見較多棕黃色顆粒，DPC4呈陽性表達（?）。SP×200

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of TGF-β1bladder urothelial cancer group：There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed TGF-β1expressed positive.S-P×200

Fig.2 The expression of TGF-β1：cancer side tissue.There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed TGF-β1expressed negative.S-P×200

Fig.3 The expression of DPC4：bladder urothelial cancer group：There were few brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed DPC4expressed negative.S-P×200

Fig.4 The expression of DPC4：cancer side tissue：There were plenty of brown particles in the nucleus or cytoplasm，which showed DPC4expressed positive.S-P×200

Expression and significance of DPC4and TGF-β1in Bladder Urothelial Cancer

Shan Guang，Tang Tian1＊
（Department of Urology，Renmin Hospital of Wuhan University；1Department of Oncology，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei 430060，China）

ObjectiveTo investigate the expression and significance of DPC4and TGF-β1in bladder urothelial cancer tissues.MethodsFifly cases of bladder urothelial cancer，parafflin-embeded specimen and 5cases of normal tissues near the bladder urothelial cancer，which were all filed in full pathological and clinical data，were collected from the pathology department of the People Hospital of Wuhan University between 2000and 2006.The expression of DPC4and TGF-β1were detected by immunohistochemical S-P method.Quantitative analysis of the DPC4and TGF-β1were measured by high definition pathological graphics context report system （HPIAS-1000）.One-way analysis of variance and SNK（q）tests were used to analyse the mean density and the positive area rate of the immunohistochemical results.All data are processed by SPSS13.0.Results（1）The expression of TGF-β1in bladder urothelial cancer was significantly higher than that in cancer side tissue（P＜0.05）.（2）The expression of DPC4in cancer side tissue was significantly higher than that in bladder urothelial cancer（P＜0.05）.ConclusionThe high expression of TGF-β1and the low expression of DPC4may promote the immuneescape of tumor cells.and the high expression of TGF-β1and the low expression of DPC4played an important role in bladder urothelial cancer development.

Bladder Urothelial Cancer；TGF-β1；DPC4；Immunohistochemistry

R735.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.014

2011-06-10

2011-08-01

陜光，男（1980年），漢族，博士，主治醫(yī)師。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）