大鼠肝癌發(fā)生過程中NF-κB的表達(dá)

李京敏 李笑巖 寧巍巍 王 東 白咸勇＊

大鼠肝癌發(fā)生過程中NF-κB的表達(dá)

李京敏1李笑巖2寧巍巍2王 東2白咸勇2＊

（1濱州醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)研究所；2濱州醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 山東煙臺264003）

目的 探討核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）在大鼠肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和意義。方法 應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法，對二乙基亞硝胺（DEN）誘發(fā)的大鼠肝癌發(fā)生過程中NF-κB的動態(tài)表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果 DEN誘發(fā)的肝癌為肝細(xì)胞癌，誘癌率為100%，大鼠肝癌癌變過程大致經(jīng)過肝細(xì)胞損傷期、肝細(xì)胞增生-硬化期和肝細(xì)胞癌變期等三個階段。在正常大鼠肝組織，偶見少量肝細(xì)胞呈陽性表達(dá)，隨著肝癌發(fā)生發(fā)展，NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞逐漸增多，至誘癌晚期，可見大量NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞，均比正常肝組織表達(dá)高（P＜0.05）。結(jié)論 本研究表明肝細(xì)胞NF-κB的過度表達(dá)與肝癌的發(fā)生和發(fā)展密切有關(guān)。

NF-κB；肝癌發(fā)生；免疫組織化學(xué)；大鼠

核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）廣泛存在于真核細(xì)胞中，具有廣泛的生物學(xué)活性，通過調(diào)控眾多基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡和炎癥反應(yīng)，其表達(dá)異常會導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生各種病理改變。近年來研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄還參與腫瘤發(fā)生過程中的細(xì)胞存活、增殖、血管生成、惡變、炎癥和凋亡抑制［1］。本實(shí)驗(yàn)采用二乙基亞硝酸胺（diethylnitrosamine，DEN）建立大鼠誘發(fā)性肝癌模型，模擬人體肝癌發(fā)生發(fā)展的過程，探討NF-κB在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)變化及作用，為闡明肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為肝癌的早期診斷和特異性藥物開發(fā)提供新思路。

材料和方法

1.材料

清潔級雄性 Wistar大鼠150只，體重150-200g，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；二乙基亞硝胺，購自Sigma公司；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體，購自北京博奧森公司；正常羊血清、兔二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德公司。

2.肝癌動物模型的制作

將150只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組（135只）和對照組（15只）。模型組飼以含DEN（80ppm）飲水，連續(xù)12周后改為自由飲水；對照組給予常規(guī)自由飲水。于實(shí)驗(yàn)的第4、8、12、16、18、20、22、24、25周，隨機(jī)選擇模型組大鼠10-15只斷頭處死，大體觀察并記錄肝臟的形態(tài)、顏色、質(zhì)地變化后，取肝組織，4%多聚甲醛緩沖液固定，常規(guī)石蠟包埋，3μm連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

3.NF-κB免疫組織化學(xué)染色（SP法）

主要操作步驟：將厚度3μm組織切片常規(guī)脫蠟至水；3%過氧化氫甲醇處理30min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶；檸檬酸緩沖液微波修復(fù)10min；正常羊血清封閉30min以減少非特異性染色；滴加兔抗大鼠NF-κB多克隆抗體，4℃過夜，以PBS代替一抗作陰性對照；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔IgG孵育30min；DAB顯色，沖洗；脫水，透明；封片。

陽性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)或胞核內(nèi)有彌漫分布的棕黃色顆粒沉積。圖片采用IMAGE-PROPLUS圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果以平均光密度值表示。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）形式表示，采用SPSS13.0軟件包進(jìn)行單因素方差分析和Bonferroni法兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.誘癌過程中大鼠肝臟的病理學(xué)變化

對照組大鼠：

肝臟肉眼觀未見明顯異常；光鏡下肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列呈索狀，圍繞小葉中央靜脈呈放射狀排列。肝細(xì)胞漿嗜酸性，核嗜堿性，多為單核，位于細(xì)胞中央（圖1A）。

模型組大鼠：

肝臟病理學(xué)變化可大致歸納為3期：①肝細(xì)胞損傷期（誘癌第1-8周）：肉眼觀肝臟未見明顯異常；光鏡下肝細(xì)胞腫脹，部分呈嗜酸性變。肝小葉結(jié)構(gòu)尚完好，小葉內(nèi)可見灶性壞死并伴有炎性細(xì)胞浸潤，逐漸出現(xiàn)纖維組織增生及肝細(xì)胞再生（圖1B）。②增生硬化期（誘癌第9-16周）：肝臟表面出現(xiàn)彌散分布的灰白色結(jié)節(jié)；鏡下可見嗜酸性或透明細(xì)胞增生灶，并形成肝細(xì)胞增生結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)內(nèi)的細(xì)胞異型性較?。▓D1C）。③癌變期（誘癌第17-25周）：肝臟表面布滿大小不等的灰白色結(jié)節(jié)，切面可見出血和壞死；鏡檢組織學(xué)類型主要為肝細(xì)胞肝癌，癌細(xì)胞排列成梁索狀或團(tuán)塊狀向周圍組織浸潤，癌周組織細(xì)胞水腫、嗜酸性變、脂肪變性，并有肝細(xì)胞增生（圖1D）

2.誘癌過程中NF-κB的表達(dá)

NF-κB免疫陽性產(chǎn)物定位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞可見胞核內(nèi)有彌散分布的棕黃色顆粒沉積。在正常大鼠肝組織，偶見少量肝細(xì)胞呈陽性表達(dá)，隨著肝癌的發(fā)生進(jìn)程，NF-κB陽性表達(dá)的細(xì)胞逐漸增多，至誘癌晚期，可見大量NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞，在癌組織內(nèi)成團(tuán)高表達(dá)，可見明顯界限。

表1 大鼠肝癌發(fā)生過程中NF-κB的表達(dá)（ˉx±s）Table 1 The expression of NF-κB during hepatocarcinogenesis in rats（ˉx±s）

圖1 誘癌過程中大鼠肝臟病理學(xué)變化（HE染色 ×100）1A：正常肝組織；1B：損傷期；1C：增生硬化期；1D：癌變期Fig.1 The pathological changes of liver tissues during hepatocarcinogenesis in rats（HE stainning×100）1A：Normal liver tissues；1B：Hepatic toxic lesion stage；1C：Hepatic proliferation／cirrhosis stage；1D：Hepatic carcinogenesis stage

圖2 大鼠肝癌發(fā)生過程中NF-κB的表達(dá)（SP法 ×400）2A：正常肝組織；2B：損傷期；2C：增生硬化期；2D：癌變期Fig.2 The expression of NF-κB during hepatocarcinogenesis in rats（SP method× 400）2A：Normal liver tissues；2B：Hepatic toxic lesion stage；2C：Hepatic proliferation／cirrhosis stage；2D：Hepatic carcinogenesis stage

討 論

肝癌是由病毒、化學(xué)致癌物等多種病因作用，由癌基因或癌相關(guān)基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新復(fù)活等諸多因素引起肝細(xì)胞生長失控而致癌變，經(jīng)啟動、促進(jìn)、演變多階段的發(fā)病過程，并與基因調(diào)控和表達(dá)等密切相關(guān)［2］。多基因、多階段癌基因或抑癌基因的變異，構(gòu)成肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)［3］。NF-κB家族由 Rel蛋白家族成員組成，以同源或異源二聚體形式存在，其N端均有一段保守的約含300個氨基酸殘基的Rel同源結(jié)構(gòu)域（rel homology domain，RHD），該結(jié)構(gòu)域包含與抑制性蛋白（IκB）結(jié)合的位點(diǎn)和Rel蛋白間聚合位點(diǎn)，同時也含有DNA識別序列及核定位序列（nuclear localization signal，NLS）［4］。 正 常 情 況 下，NF-κB主要位于胞質(zhì)內(nèi)，與IκB結(jié)合，處于非活性狀態(tài)。當(dāng)受到細(xì)胞因子等刺激因子作用后，IκB激酶復(fù)合物（IKK）被激活，與 NF-κB結(jié)合的IκB被IKK 磷酸化，發(fā)生多泛素化，與泛素結(jié)合后的IκB發(fā)生構(gòu)象改變，可被蛋白酶識別并降解，此時NF-κB游離并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及對化學(xué)藥物耐藥等作用［5］。

Pikarsky等［6］研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB在促進(jìn)炎癥相關(guān)性肝癌的發(fā)生中起重要作用。王以浪等［7］通過檢測35例肝癌灶組及其自身對照的非癌組織NF-κB的表達(dá)，分析NF-κB表達(dá)與HBV復(fù)制及臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)癌組織NF-κB表達(dá)強(qiáng)度明顯高于癌周組織，NF-κB信號通路的過度激活與HBV相關(guān)性肝細(xì)胞肝癌形成密切相關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常大鼠肝組織，偶見少量肝細(xì)胞呈NF-κB陽性表達(dá)，隨著肝癌發(fā)生進(jìn)程，NF-κB陽性表達(dá)細(xì)胞逐漸增多，至癌變晚期，癌團(tuán)中存在NF-κB廣泛高表達(dá)及異常激活，提示活化后的NF-κB通過調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的表達(dá)，如上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2，從而促進(jìn)癌細(xì)胞存活、增殖、侵襲以及腫瘤血管生成，在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了的重要作用；肝細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)隨著肝癌發(fā)生發(fā)展而進(jìn)行性增加，也反映了肝細(xì)胞的早期惡性轉(zhuǎn)化及惡變程度，提示NF-κB可以作為肝癌早期診斷的指標(biāo)。NF-κB信號通路與眾多信號通路相互調(diào)控，在調(diào)控腫瘤發(fā)生發(fā)展及凋亡的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)中處于核心環(huán)節(jié)［8，9］，據(jù)此我們認(rèn)為可以研究設(shè)計(jì)以NF-κB為特異靶點(diǎn)的肝癌治療方案，通過抑制NF-κB的活性，以降低肝癌化療的耐藥性，提高治療效果。

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Expression of NF-κB during hepatocarcinogenesis in rats

Li Jingmin1，Li Xiaoyan2，Ning Weiwei2，Wang Dong2，Bai Xianyong2＊
（1Institute of Human Anatomy and Histology and Embryology，Binzhou Medical College；2Department of Histology and Embryology，Binzhou Medical College，Yantai，Shandong264003，China）

ObjectiveTo discuss the role and significance of nuclear factor-κB（NF-κB）during hepatocarcinogenesis in rats.MethodsThe dynamic expression of NF-κB during hepatocarcinogenesis induced by diethylnitrosamine（DEN）in rats was investigated by immunohistochemical SP method.ResultsHepatocellular carcinoma was induced by DEN in all cases.The process of hepatocarcinogenesis in this model included three stages：hepatic toxin lesion，hepatic proliferation／cirrhosis，and hepatic carcinogenesis.An increasing tendency of NF-κB expression was shown from normal liver to precancerous to cancerous tissues with the progress of rat hepatocarcinogenesis，and a large number of NF-κB positive cells were shown at the terminal cancer stage，compared to the lower expression in normal liver tissues（P＜0.05）.Conclusion The results suggest that the overexpression of NF-κB in hepatocytes is related closely to the occurrence and progression of hepatoma.

NF-κB；Hepatocarcinogenesis；Immunohistochemistry；Rat

R329

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.007

2010-12-27

2011-06-27

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金（01BS51）

李京敏，女（1983年），漢族，碩士。

＊通訊作者（To whom correspondence should be addressed）